Summary
Мы показываем, как волосатый корень композитных растения могут быть использованы для изучения растительного Rhizobium взаимодействия и узелков в трудных для преобразования вида
Abstract
Как и в Agrobacterium tumerfaciens, Agrobacterium rhizogenes могут переводить иностранную ДНК в клетки растений на основе автономного корневого вызывающие (Ri) плазмиды. A. rhizogenes может привести к образованию волосатый корень на растительные ткани и форму композитных растений после трансформации. На этих составных растений, некоторые из регенерированного корни являются трансгенными, неся дикого типа Т-ДНК и инженерии двоичный вектор, в то время побеги еще нетрансгенных, служа для получения энергии и роста поддержки. Эти волосатые корень композитных растений не будет производить трансгенных семян, но Есть ряд важных особенностей, которые делают эти составные растения очень полезны в растительных исследований. Во-первых, с широким кругом хозяин, А. rhizogenes может превратить многие виды растений, особенно двудольных, позволяя генной инженерии в различных видов. Во-вторых, А. rhizogenes заражают ткани и эксплантов напрямую, не тканевых культур до преобразования, необходимые для получения композитных растений, что делает их идеальными для преобразования непокорных видов растений. Кроме того, трансгенные тканей корень может быть создан в течение нескольких недель. Для Medicago прудовик, можно получить трансгенных корни в максимально короткими три недели быстрее, чем обычные цветочные падение Arabidopsis трансформации. В целом, волосатый корень композитных технологий завод является универсальным и полезным инструментом для изучения функций генов и корень связанными фенотипы. Здесь показано, как волосатый корень композитных растения могут быть использованы для изучения растительного Rhizobium взаимодействия и узелков в трудных для преобразования видов M. прудовик.
Protocol
Следующий протокол был использован для создания волосатый корень композитных растений в модели бобовых видов M. прудовик. Аналогичные протоколы были адаптированы для по меньшей мере восемь видов растений 1-4. Мы использовали М. прудовик волосатый корень композитных растений для изучения функций генов в корень и узелок развития. Протокол был разделен на четыре раздела: 1) подготовка растительных материалов, 2) генерации волосатый корень композитных растений, 3) симбиотических инфекции ризобии и 4) трансгенных корневой идентификации. Мы использовали двоичный вектор, содержащий зеленый флуоресцентный белок (GFP) гена в качестве репортера для скрининга трансгенных корень в композитных растений 3. По сравнению с антибиотиками основе отбора, GFP-скрининг это просто, быстро и недорого. В нашей конструкции, ЭР-выражение оптимизированный ген GFP управляется супер убиквитин промоутер, который имеет сильного конститутивного сигналы GFP у трансгенных корней, что позволяет легко различия между трансгенной и не-трансгенных корней.
1. Подготовка материалов завод
- М. truncautla семена собирают с растений, выращенных в теплице (50% относительной влажности, 16 / 8 ч свет / тьма, 22/18 ° C день / ночь температура). Зрелые семена могут храниться при температуре 4 ° C.
- Около 100 Семена раскритиковали в 10 мл концентрированной серной кислоты (95-98%, Sigma-Aldrich, МО) в течение 10 мин при периодическом встряхивании.
- Семена промывают 5-7 раза стерильной водой с мягким агитации.
- Семена затем замачивают в воде при комнатной температуре в течение 6 часов и хранить при температуре 4 ° С в течение 36-48 часов, чтобы синхронизировать прорастания.
- Примерно 20-30 семена распространяются на влажной фильтровальной бумаги помещают в чашку Петри. Они ведутся при 22 ° С, с 16 / 8 ч свет / темно-цикла, и 40 μmol.m -2. С -1 интенсивность света, в течение 5-6 дней.
- Проросшие саженцы переносят в почву и помещают в теплицы для месяц.
2. Генерация Волосатый Корневая Композитный Растения
- Двоичные конструкций проведения гены интереса были преобразованы в А. rhizogenes с помощью стандартных протоколов. У нас разработан набор бинарных векторов, содержащих ген GFP в качестве маркера, которые облегчают отбор трансгенных тканях. Эти векторы содержат различные промоутеры и все они имеют шлюз клонирования сайтов (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния), более-выражение или глушителей целевых генов 3,5.
- А. rhizogenes культивируют в 50 мл LB среды с соответствующим антибиотиком выбора при 28 ° С в течение 16-24 часов.
- Бактерии собираются и вновь приостановлено до конечной концентрации OD 600 = 0,3 в безазотистые решение питательных веществ для растений (табл. 1 и 6).
- Для поддержки волосатые регенерация корня, стерилизовать поддержки матрицы ("Минеральная вата", Hummert International, Земля City, MO) разрезается на пробки примерно 3 см 3. Мы размещаем 4 разъемами в одну чашку Петри.
- Отверстие тыкали друг на плагин с помощью пипетки наконечник для облегчения вставки эксплантов. A. rhizogenes (5 мл) добавляют в каждую пробку.
- Стрелять раздел с 2-3 пазушных почек иссекается по косой разрез. Эксплантов затем вставляется в разъем, и, выращенных при 22 ° С в течение примерно трех недель. Мы продолжаем Medicago эксплантов без полива в течение первых 10 дней, затем, поливать их по 5 мл безазотистые решение в случае необходимости. Мы обнаружили, что удаление апикальной меристемы может уменьшить образование придаточных корней.
3. Симбиотические ризобии (Sinorhizobium Meliloti) Инфекция
- После трех недель, некоторые придаточные корни выйдет из минеральной ваты. Волосатый корень композитных растений передаются песка или вермикулита (стерилизованные), с или без минеральной ваты. Они выращены в теплице при 22 ° С, 16 / 8 ч свет / темно-цикла, и 300 μmol.m -2. С -1 интенсивности света на еще одну неделю.
- До ризобии инфекции, С. meliloti 1201 выращиваются в 50 мл экстракта дрожжей-маннита среду в течение 7 дней при 30 ° С (табл. 2 и 6,7).
- Повторно приостановлены ризобии клетки разбавляют до конечной концентрации OD 600 = 0,08 с использованием азота бесплатное решение питания. 10-мл свежего приостановлении С. meliloti был применен к каждой составной растение, чтобы вызвать образование узелков.
4. Трансгенные Идентификация корневых
- Через две недели после прививки ризобии, композитный растения до укоренившиеся промывкой в воде. Корни можно легко отделить от песка или перлита в воде.
- Мы размещаем волосатые корни под УФ-микроскоп (Nikon SMZ1500, Возбуждение 460-500 нм, дихроичным 505nm, Барьер более 510nm). Трансгенные корни GFP положительные и придаточные корни GFP отрицательным. Затем мы собираем корни Accordinг сигнал GFP, и рассчитывать узелок чисел, мера длины корня, и вычислить плотность боковых корней. GFP отрицательных корней используют в качестве контроля.
5. Представитель Результат
В нашем эксперименте новые корни волос восстанавливается из эксплантов в течение 2-3 недель после А. rhizogenes прививок. Под ультрафиолетовым микроскопом, трансгенные корни несущих ген GFP показывают уверенный зеленая флуоресценция (рис. 1). Количество регенерировать корни и часть GFP положительных корней зависит от условий эксплантов и роста среды составную среднюю plants.On, 25% корней производится были трансгенных волосатые корни 3. Для повышения эффективности трансформации, 1) пластиковая крышка обреченности, как показано на видео, достаточно для поддержания влажности в росте лоток в течение первых нескольких дней, и растения требуют лишь немного воды в первые несколько дней. Чрезмерный полив ущерб волосатые корнеобразования, 2) концентрация Agrobacterium innoculant важна для трансформации. Чрезмерное количество клеток не полезно волосатой формирование корня или образование узелков. Для образование узелков, поливной воды должна быть безазотистые, в противном случае будет несколько узелков форме.
Волосатый корень композитных растения могут быть созданы с помощью семядоли или entact рассады в качестве исходного материала. Лишь незначительные модификации выше протокола ncessary генерировать волосатые корни из других тканей 8. Важно отметить, что каждый волосатый корень независимое событие трансформации. Таким образом, фенотип наблюдается в один композитный завода суммы нескольких событий transforamtion, которые должны быть подтверждены в нескольких повторений композитных растений
Рисунок 1. А. Трансгенные корни могут быть отсортированы от волосатых корней. B. Узлы были сформированы в волосатый корень композитных растений. Мы, расположенный на 4-недельных М. прудовик волосатый корень растения под УФ-микроскоп и GFP положительных корней могут быть легко идентифицированы. (Красная стрела: GFP корень; Желтая стрела: не GFP корень)
| Акции | g/200ml | мл акции / литр |
| MgSO 4 .7 H 2 O | 12,3 | 2 |
| CaCl 2 · 2H 2 O | 14,7 | 4 |
| K 2 HPO 4 0,3 H 2 O | 6,8 | 1 |
| K 2 SO 4 | 11 | 4 |
| Fe Cl 3 0,6 H 2 O | 0,49 | 2,5 |
| Микроэлементы | См. ниже | 1 |
| Микроэлементы | г на литр |
| H 3 BO 3 | 0,142 |
| MnSO 4. H 2 O | 0,077 |
| ZnSO 4 .7 H 2 O | 0,1725 |
| CuSO 4 .5 H 2 O | 0,037 |
| NaMoO 4. H 2 O | 0,024 |
| CoCl 2. H 2 O | 0,0025 |
| NiSO 4 | 0,001 |
Таблица 1. Nitogen без питания решение
| K 2 HPO 4 | 0,5 г |
| NaCl | 0,1 г |
| MgSO 4 · 7H 2 O | 0.2g |
| Дрожжевой экстракт | 0,4 г |
| Маннитол | 10g |
| рН = 6,8 |
Таблица 2. Дрожжевой экстракт маннитол среды (на литр)
Discussion
Создание волосатый корень композитных завод быстрый и легкий способ получения большого количества трансгенных материал для многих двудольных видов. Хотя этот метод не может производить трансгенные семена, он может производить трансгенных материалов в течение нескольких недель. Метод особенно подходит для растений, которые имеют трудности создания тканевых культур или создание стабильных трансформантов. На протяжении многих лет мы использовали эту технологию для изучения функций генов, промоутер функций, микроРНК, корня и боковых развития корневой системы, обороны и ответы абиотических стрессов, узелков и других симбиотических процессов, гормональных реакций, метаболических профилей, генная профилирование, протеомных анализа и другими биологическими процессами. Протокол надежной и воспроизводимой.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить д-р Крис Тейлор (Университет штата Огайо) для внедрения технологии волосатый корень нашей лаборатории, и доктора. Senthil Subramanian (Государственный университет Южной Дакоты), Хуан Жанг (Ludong университета, Шаньдун Китая) для улучшения протокола. Мы также благодарим доктора Хао Ченг (Нанкин аграрный университет) по помогает в создании этого видео. Эта работа выполнена при частичной поддержке грантов от Министерства энергетики (DE-SC0001295), NSF (MCB-0923779) и Министерства сельского хозяйства США (2010-65116-20514) до OY
References
- Limpens, E., Ramos, J., Franken, C., Raz, V., Compaan, B., Franssen, H., Bisseling, T., Geurts, R. RNA interference in Agrobacterium rhizogenes-transformed roots of Arabidopsis and Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 55, 983-992 (2004).
- Collier, R., Fuchs, B., Walter, N., Kevin, L. W., Taylor, C. G. Ex vitro composite plants: an inexpensive, rapid method for root biology. Plant J. 43, 449-457 (2005).
- Zhang, J., Subramanian, S., Stacey, G., Yu, O. Flavones and flavonols play distinct critical roles during nodulation of Medicago truncatula by Sinorhizobium meliloti. Plant J. 57, 171-183 (2009).
- Boisson-Dernier, A., Chabaud, M., Garcia, F., Becard, G., Rosenberg, C., Barker, D. G. Agrobacterium-rhizogenes-transformed roots of Medicago truncatula for the study of nitrogen-fixing and endomycorrhizal symbiotic associations. Mol. Plant-Microbe Interact. 14, 695-700 (2001).
- Zhang, J., Subramanian, S., Zhang, Y., Yu, O. Flavone synthases from Medicago truncatula are flavanone-2-hydroxylases and are important for nodulation. Plant Physiol. 144, 741-751 Forthcoming.
- Subramanian, S., Hu, X., Lu, G., Odelland, J., Yu, O. The promoters of two isoflavone synthase genes respond differentially to nodulation and defense signals in transgenic soybean roots. Plant Mol Biol. 54, 623-639 (2004).
- Vincent, J. A manual for the practical study of root nodule bacteria International Biological Program Handbook. , Blackwell Science Ltd. Oxford. 1-13 (1970).
- Subramanian, S., Graham, M. Y., Yu, O., Graham, T. L. RNA Interference of Soybean Isoflavone Synthase Genes Leads to Silencing in Tissues Distal to the Transformation Site and to Enhanced Susceptibility to Phytophthora sojae. Plant Physiol. 137, 1345-1353 (2005).
