Summary
We beschrijven het gebruik van een muis ES-cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. De methode biedt een gestandaardiseerd platform dat betrouwbaar kwantificeert cardiogene efficiëntie, en het is van toepassing op de studie van andere cellijnen.
Abstract
Differentiatie van pluripotente stamcellen wordt streng gecontroleerd door de temporele en ruimtelijke regulering van meerdere belangrijke signaalwegen. Een van de obstakels om haar te begrijpen is het gevarieerde methoden in correleren van veranderingen van belangrijke gebeurtenissen signalering tot differentiatie efficiency. We beschrijven hier het gebruik van een muis embryonale stamcellen (ES) cel-gebaseerde test kritische tijdvensters voor de Wnt / β-catenine en BMP signaal activering tijdens cardiogene inductie te identificeren. Door het scoren voor het oplopen van embryonale organen (EBS) in een 96-well plaat formaat, kunnen we snel kwantificeren cardiogene efficiency en identificeren van cruciaal moment ramen voor Wnt / β-catenine en BMP-signaal activering in een tijdsverloop volgende specifieke modulator behandelingen. De belangrijkste hier beschreven is niet beperkt tot cardiale inductie alleen, en kan worden toegepast op de studie van vele andere cellijnen. Daarnaast is de 96-well formaat heeft de potentie om verder te worden ontwikkeld als een high throughput, geautomatiseerde test om te zorgen voor het testen van meer geavanceerde experimentele hypothesen.
Protocol
1. Embryonale Body (EB) vorming met behulp van 96-ronde bodem goed microtiterplaten
- Grow muis ES-cellen in 10cm celkweek platen met de muis ES-cel medium aangevuld met LIF.
- Wanneer ES-cellen zijn klaar voor gebruik (over het algemeen bij 50-70% confluentie), verwijder ES media en een keer spoelen cellen met 5 ml steriele PBS.
- Voeg 2 ml 0,05% trypsine / EDTA op elk bord en Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende 3 ~ 5 minuten, Quench trypsine EDTA met 3 ml ES media.
- Overdracht cellen tot 50 ml valk buizen en draaien op 1000 rpm gedurende 3 minuten.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof, en resuspendeer celpellet met de gewenste hoeveelheid EB media.
- Tel het aantal cellen en verdun cellen om 5 x10 3 cellen / ml in EB media.
- Gebruik multichannel pipet om 100μl van EB media toe te voegen met daarin cellen in elke well van de 96 - ronde goed microtiterplaten.
- Plaats 96 - ronde goed microtiterplaten in een couveuse.
2. Identificatie van de kritische tijdvensters van de belangrijkste signaalweg (s) voor cardiogenese
- Voeg modulatoren van specifieke signaalwegen en controle over het voertuig in elke well van de 96-well microtiterplaten met ES-cellen op verschillende tijdstippen, zoals dag 0, dag 1, dag 2, dag 3 en dag 4, etc. De helft van de putten in elk 96 -wells plaat (48 wells) worden gebruikt voor elke uitgangspunt tijdstip van de behandeling.
- Was de modulatoren door het veranderen van EB media voor elke 48 putten op verschillende stoptijd punten. Bijvoorbeeld, om twee dagen voor de behandeling van ES-cellen vanaf dag 0 te krijgen, was uit modulators op dag 2. Voor elke behandeling langer dan 48 uur, veranderen EB media aangevuld met verse modulatoren om de twee dagen tot de gewenste stoptijd punten.
- Onderzoek EB samentrekking onder een microscoop na dag 7. Scoren de putten met de aanbestedende EBS als positieve aan percentages van de aanbestedende EBS voor elk verschillend behandelingstijd cursussen te volgen.
- De kritische tijdstippen voor ES cardiogenese zijn de termijnen waarin die het hoogste percentage van de aanbestedende EBS behandeld door signalering modulatoren in vergelijking met het voertuig onder controle.
3. Verificatie van de tijdvensters in signalen voor cardiogenese in EBS uit opknoping druppeltjes
- Bereid Petrischalen door het toevoegen van met 3-4 ml PBS om verdamping te voorkomen.
- Volg de stappen 1,1 ~ 1,5 tot ES-cellen te bereiden op 2.5x10 4 cellen / ml laatste cel dichtheid.
- Giet het mengsel in cell bacteriële schaal voor gemakkelijke toegang. Met behulp van multichannel pipet, voeg 20 pl druppels (met ongeveer 500 cellen) op omgekeerde deksels. Sta niet toe dat de individuele druppeltjes aan te raken. Over het algemeen een deksel kan geschikt tot 80 druppels. Back flip het deksel op het schaaltje met PBS. Incubeer 24 uur of 48 uur aan EB-vorming in een incubator mogelijk te maken.
- Spoelen EB gevormd uit opknoping druppeltjes uit elke deksel met 3 ml van EB media en zwembad twee deksels van EBS aan een nieuwe petrischaal. Voeg EB media om een totaal volume van 10 ml.
- Overdracht EBS in suspensie op 0,2% gelatine beklede 6-well platen op dag 4. In het algemeen 30 EBS worden overgedragen aan elke well. Voeg EB media om de 2 ml uiteindelijke volume voor elk putje te krijgen.
- Incubeer signalering modulatoren in de periode geïdentificeerd van 96-well plaat experimenten.
- Let op de EB samentrekking onder de microscoop na dag 7 en cardiogenese kan verder worden gekarakteriseerd door RT-PCR, immunokleuring en anderen, indien nodig.
Discussion
De opknoping druppel methode is de conventionele methode die wordt gebruikt voor EB vorming en in vitro differentiatie. Het is echter bewerkelijk en de grenzen experimentele flexibiliteit als gevolg van logistieke problemen. Op dezelfde wijze, resultaten zijn ook moeilijker te valideren als de vaardigheid van de onderzoeker is cruciaal voor een succesvolle EB vorming en manipulatie als opknoping daalt. Een eenvoudiger methode is om EBS vorm in een ronde bodem 96-well plaat als een single-step proces. Dit formaat kan in vitro differentiatie worden gestandaardiseerd en kan meer experimentele omstandigheden te wijten aan het gemak van EB vorming en stroomafwaarts manipulatie (bijv. modulator toevoegen of verwijderen). Bovendien kan de 96-well plaat formaat worden geoptimaliseerd om een efficiënte screening tool in de muis ES-cellen.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door Veterans Affairs en NIH beurzen 5U01HL100398 en 1R01HL104040.
Materials
| Mouse CGR8 cells are mainly used. | |||
| ES medium: GMEM media supplemented with 10% heat-inactivated FBS, 2 mM L-glutamine, 0.05 mM 2-mercapt–thanol, and 200 U/ml murine LIF. | |||
| EB medium: Prepare IMDM media with 20% heat-inactivated FBS, 1.6 mM L-glutamine, 0.08 mM 2-mercapt–thanol, and 1X MEM Non-essential amino acid solution. |
References
- Fukuda, K., Yuasa, S. Stem cells as a source of regenerative cardiomyocytes. Circulation research. 98, 1002-1013 (2006).
- Foley, A. C., Mercola, M. Heart induction by Wnt antagonists depends on the homeodomain transcription factor Hex. Genes Dev. 19, 387-396 (2005).
- Naito, A. T., Shiojima, I., Akazawa, H., Hidaka, K., Morisaki, T., Kikuchi, A., Komuro, I. Developmental stage-specific biphasic roles of Wnt/beta-catenin signaling in cardiomyogenesis and hematopoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 19812-19817 (2006).
- Hao, J., Daleo, M. A., Murphy, C. K., Yu, P. B., Ho, J. N., Hu, J., Peterson, R. T., Hatzopoulos, A. K., Hong, C. C. Dorsomorphin, a selective small molecule inhibitor of BMP signaling, promotes cardiomyogenesis in embryonic stem cells. PloS one. 3, e2904-e2904 (2008).
