Haute Sensibilité 5-hydroxyméthylcytosine détection dans le tissu cérébral des souris Balb / C

Summary

Le EpiMark 5-HMC et le kit d'analyse 5-MC peut être utilisé pour analyser et quantifier 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine au sein d'un locus de SPE spécifiques. Le kit distingue 5-MC à partir de 5-HMC par l'ajout de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-HMC via une réaction enzymatique utilisant β-glucosyltransférase (T4-TBG). Lorsque 5-HMC survient dans le contexte de la CCBG, cette modification convertit un site clivable Mspl à un site non clivable.

Abstract

Hydroxyméthylation ADN est une modification de l'ADN connue depuis longtemps, mais est récemment devenu un foyer dans la recherche en épigénétique. L'ADN des mammifères est enzymatiquement modifiés à la position du carbone 5 ^ème de la cytosine (C) aux résidus 5-MC, principalement dans le contexte des dinucléotides CpG. 5-MC se prête à l'oxydation enzymatique de 5-HMC par la famille du Têt des enzymes, qui sont soupçonnés d'être impliqués dans le développement et la maladie. Actuellement, le rôle biologique de 5-HMC n'est pas entièrement comprise, mais suscite beaucoup d'intérêt en raison de son potentiel en tant que biomarqueur. Cela est dû à plusieurs études novatrices d'identification 5-hydroxyméthylcytosine chez la souris souches embryonnaires (ES) et les cellules neuronales.

Les techniques de recherche, y compris les méthodes de bisulfite de séquençage, sont incapables de distinguer facilement entre 5-MC et 5-HMC. Quelques protocoles existent qui peuvent mesurer des montants globaux de la 5-hydroxyméthylcytosine dans le génome, dont la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse ou chromatographie sur couche mince de nucléosides seule digéré de l'ADN génomique. Les anticorps qui cible 5-hydroxyméthylcytosine existent également, qui peut être utilisé pour l'analyse dot blot, immunofluorescence, ou à la précipitation d'ADN hydroxyméthylés, mais ces anticorps n'ont pas seule plus resolution.In de base, la résolution dépend de la taille de l'ADN et pour immunoprécipité expériences biopuces, dépend de la conception de la sonde. Comme il ne sait pas exactement où 5-hydroxyméthylcytosine existe dans le génome ou de son rôle dans la régulation épigénétique, de nouvelles techniques sont nécessaires qui peuvent identifier hydroxyméthylation locus spécifique. Le EpiMark 5 HMC et 5-MC Analyse kit offre une solution de distinction entre ces deux modifications à des loci particuliers.

Le EpiMark 5-HMC et analyse 5-MC Kit est une méthode simple et robuste pour l'identification et la quantification de la 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine dans un locus d'ADN spécifiques. Cette approche enzymatique utilise la sensibilité méthylation différentielle de l'Mspl isoschizomères et Hpall dans un simple en 3 étapes du protocole.

L'ADN génomique d'intérêt est traitée avec T4-TBG, l'ajout d'un moeity glucose à 5-hydroxyméthylcytosine. Cette réaction est indépendante de la séquence, donc tous les cinq-HMC sera glucosylés; non modifiés ou 5-MC ADN contenant ne sera pas affectée.

Cette glucosylation est alors suivie d'une digestion par endonucléase de restriction. Mspl et Hpall reconnaissent la même séquence (CCBG), mais sont sensibles à la méthylation états différents. Hpall clive seulement un site totalement non modifiée: toute modification (5-mC, 5-HMC ou 5-ghmC) soit à un clivage des blocs de cytosine. Mspl reconnaît et clive 5-MC et 5-HMC, mais pas 5 ghmC.

La troisième partie de ce protocole est l'interrogation du locus par PCR. Aussi peu que 20 ng d'ADN d'entrée peuvent être utilisés. Amplification de l'expérimental (glucosylés et digéré) et de contrôle (maquette glucosylés et digéré) avec des amorces d'ADN cible flanquant un site CCBG d'intérêt (100-200 pb) est effectuée. Si le site contient des CpG 5-hydroxyméthylcytosine, une bande est détecté après glucosylation et la digestion, mais pas dans la réaction de contrôle non-glycosylées. PCR en temps réel donne une approximation de combien hydroxyméthylcytosine est dans ce site particulier.

Dans cette expérience, nous allons analyser la quantité de 5 hydroxyméthylcytosine dans un échantillon de cerveau de souris Babl / C par PCR point final.

Protocol

1. Glucosylation ADN et contrôler les réactions

1. Dans un tube de réaction 1,5 millilitre sur la glace, mélanger microgrammes 5-10 de l'ADN génomique (pour une concentration finale de 30 microgrammes / millilitre), 12,4 microlitres de l'UDP-glucose (pour une concentration finale de 80 micromolaire), 31 microlitres de NEBuffer 4 et jusqu'à 310 microlitres eau sans nucléase pour porter le volume total à 310 microlitres.
2. Fractionner ce mélange réactionnel dans deux tubes de 155 microlitres chacun.
3. Puis ajouter 30 unités, soit 3 microlitres, de T4-β-glucosyltransférase à un tube. Bien mélanger en douceur aspiration et refoulement. Le deuxième tube est la réaction de contrôle, donc ajoutez 3 microlitres d'eau, au lieu de T4-BGT.
4. Incuber les deux tubes à 37 degrés Celsius pendant 12 à 18 heures, période pendant laquelle le T4-BGT va ajouter de glucose pour le groupe hydroxyle de 5-hydroxyméthylcytosine groupes de l'échantillon.

2. Digestion enzymatique de restriction

1. Étiquette trois 0,2 millilitre PCR bande numéros 1 à 3 tubes. Aliquote de 50 ul du mélange réactionnel dans chaque.
2. Étiquette trois 0,2 millilitre PCR bande numéros tubes 4 à 6. Aliquote de 50 ul du mélange de contrôle dans chaque.
3. Ajouter 100 unités, soit 1 microlitre, des Mspl dans des tubes 1 et 4. Bien mélanger en douceur aspiration et refoulement.
4. Ajouter 50 unités, soit 1 microlitre de Hpall dans des tubes de 2 et 5. Bien mélanger en douceur aspiration et refoulement.
5. Ne pas ajouter quoi que ce soit à des tubes 3 et 6, car ils sont les témoins.
6. Incuber tous les tubes de 6 à 37 degrés Celsius pendant au moins 4 heures.
7. Ajouter 1 microlitre de la protéinase K dans chaque tube et incuber à 40 degrés Celsius pendant 30 minutes.
8. Inactiver la protéinase K par une incubation à 95 degrés Celsius pendant 10 minutes.

3. Analyser l'ADN par PCR / qPCR

Ce protocole utilise ONÉ LongAmp Taq pour point final de PCR qui a été montré à bien performer. D'autres protocoles de PCR peut être substitué.

1. Ajouter les éléments suivants dans un tube de 0,2 ml PCR sur glace: 10 microlitres de tampon de réaction 5X LongAmp Taq, 1,5 microlitres de dNTP 10 mM, 1 microlitre de 10 amorce sens micromolaires, 1 microlitre de 10 amorce reverse micromolaires, 3 microlitres de template l'ADN à partir des étapes précédentes, 1 microlitre de la polymérase Taq ADN LongAmp, et une eau sans nucléase jusqu'à 50 microlitres. Ces volumes peuvent changer selon le protocole de PCR utilisées.
2. Mélanger délicatement la réaction. Si nécessaire, recueillir tout le liquide au fond du tube par un tour rapide.
3. Superposition de l'échantillon avec de l'huile minérale si vous utilisez un thermocycleur sans couvercle chauffant.
4. Transférer les tubes de PCR de la glace à un thermocycleur avec le bloc préchauffé à 94 degrés Celsius et démarrer le programme de cyclisme. Pour une routine 3-étape de PCR, il devrait y avoir une étape de dénaturation initiale à 94 degrés Celsius pendant 30 secondes, suivi par 30 cycles de 94 degré Celsius la dénaturation pendant 15 secondes, 55 à 65 degrés Celsius recuit pendant 30 secondes, et 65 degré Celsius d'extension pendant 20 secondes ou 50 secondes par ko. Cela devrait être suivi par une extension finale à 65 degrés Celsius pendant 5 minutes. PCR en temps réel peut également être réalisée pour quantifier des quantités de 5-méthylcytosine et 5-hydroxyméthylcytosine. S'il vous plaît se référer à la notice du produit, trouvé sur neb.com pour des informations spécifiques.

4. Les résultats représentatifs:

Figure 1. Comparaison de la 5-hydroxyméthylcytosine sommes au locus 12 dans des échantillons de tissus de souris différents Balb / C. (A), point final de PCR. (B), PCR temps réel.

L'ADN à partir de quatre tissus de la souris a été analysée. Pour fins de comparaison, PCR en temps réel les données ont été normalisées à l'ADN non coupé. Une courbe standard a été utilisé pour déterminer le nombre de copies. Les échantillons peuvent être normalisées en divisant le nombre de copies d'échantillons Aucun 1-6 par le nombre de copies du contrôle qui est non digérées (no 5). Voies de gel Boxed montre la variation en 5-HMC présents.

Discussion

Il ya plusieurs choses essentielles à considérer lors de la mise en place de cette expérience. Premièrement, il est important que le glucosylation d'ADN génomique provenant d'achèvement. La spécificité de séquence de T4-BGT n'est pas connue, et il ne semble pas avoir le choix pour la séquence de substrat. Par conséquent, dans certains cas, les temps d'incubation plus longue peut être nécessaire. Seconde digestion, Mspl et Hpall doit être complète afin d'éviter un signal de fond. Pour ces enzymes de restriction, nous recommandons un temps d'incubation de 4 heures, mais plus d'incubations peuvent être réalisées lors clivage incomplet est observée. Troisièmement, le montant ADN d'entrée peut être ajustée en fonction de la disponibilité, depuis le 20 END de l'ADN peuvent être utilisés pour point final de PCR. Enfin, nous recommandons l'utilisation de l'ADN de contrôle fourni, qui peut être exécuté en parallèle avec l'ADN génomique pour la 5-MC et 5-HMC quantification.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EpiMark™ 5-hmC and 5-mC Analysis Kit	New England Biolabs	E3317
Locus specific primers, flanking a CCGG site of interest			Custom per experiment; provided by user
LongAmp® Taq DNA Polymerase	New England Biolabs	M0323
dNTPs	New England Biolabs	N0447
molecular biology grade water