우리는 autoinflammatory phenotypes와 함께 제시 환자에있어서 IL - 1 베타의 생산과 같은 프로 염증성 크린 시토킨의 생산, 측정하는 간단한 면역 분석법을 설명합니다. 특히 lipopolysaccharide와 병원체 - 관련된 분자 패턴과 전체 혈액 배양에서 세포를 활성화하여, 시토킨 분비가 편리 전체 혈액 supernatants에서 평가하실 수 있습니다.
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방법 논문
전체 혈액 자극 분석을 사용하여 프로 염증성 시토킨 IL - 1β의 정확하고 간단한 측정
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이 논문에서
요약
초록
면역 세포에 의해 용해 중재자의 분비로 인한 염증성 과정, 피부, 관절과 기타 조직뿐만 아니라 변경 시토킨 항상성의 다양한 발현로 이어집니다. 타고난 면역 체계는 병원균과 다른 내생 위험 자극의 인식에 중요한 역할을 담당하고 있습니다. 타고난 면역 세포에 의해 발표 주요 크린 시토킨 중 하나는 인터루킨 (IL) -1입니다. 따라서, 우리는 염증 크린 시토킨의 분비를 측정하기 위해, 특히 프로 염증 시토킨 IL - 1β 1, 2, 3의 전체 혈액 자극 분석을 활용한다.
autoinflammatory syndromes를 일으키는 본래 면역 시스템의 유전자 장애 환자는 혼자 LPS로 자극시 IL - 1β 성숙의 과장 릴리스를 보여줍니다. 염증 - 관련 pathologies로 현재 환자의 타고난 면역 구성 요소를 평가하기 위해, 우리는 그람 음성 세균의 내독소 같은 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs)에 세포 면역 반응을 감지하는 특정 면역 분석법, lipopolysaccharide (LPS를 사용하여 ). 이러한 PAMPs은 본래 면역 체계 4, 5, 6, 7의 세포에서 찾을 수있는 병원체 인식 수용체 (PRRs)에 의해 인정됩니다. 보조 신호, ATP, inflammasome의 활성화, 그 성숙, bioactive 형태 4, 5, 6, 8, 9 프로 IL - 1β 처리하는 multiprotein 복합 필요한 함께 기본 신호, LPS, 10.
전체 혈액 분석은 특정 세포 집단의 노동 집약적인 고립과 culturing을 필요로 다른 방법에 비해 시토킨 생산을 평가하기 위해 최소한의 샘플 조작이 필요합니다. 이 방법은 다른 모든 혈액 자극의 assays 다릅니다; 오히려 RPMI 미디어의 비율로 샘플을 diluting보다, 우리는 백혈구가 희석 전체 혈액에서 직접 계산되므로, 문화 2 백혈구의 알려진 숫자를 자극 수행합니다. 이 특정 전체 혈액 분석의 결과는 autoinflammatory pathophysiologies와 함께 제시 환자의 동료를 elucidating에 도움이 소설 기법을 보여줍니다.
프로토콜
1. 전체 혈액 수집
- 영향을받는 개인뿐만 아니라 나이, 성별 일치하는 건강한 컨트롤에서 말초혈 10 ML 최소를 얻습니다. 정맥 혈액이 아니라 나트륨 헤파린과 적절한 혼합을 보장하기 위해 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 그리고 거꾸로 여러 번 같은 다른 anticoagulants를 사용하여보다 나트륨 헤파린의 vacutainer 혈액 수집 튜브에 수집한다. 10 ML이 특정 검정에 대한 중복의 도금 샘플에 필요한 전체 혈액의 최소 볼륨입니다.
- 샘플은 최상의 결과를 위해 수집 후 가능한 빨리 처리되어야합니다. 최대 24 시간 (2) 처리 될 준비까지를 위해 그러나, heparinized 혈액이 희미한 조명 아래의 상온에서 저장할 수 있습니다.
2. 전체 혈액의 준비
- 상온 10 분 3,000 RPM (브레이크가 해제된 상태로)에서 모든 혈액 샘플을 원심 분리기. 버피 코트를 방해하지 않고, 플라즈마는 위로부터 수집된 수 있으며, 다른 실험 목적을 위해 저장됩니다. 플라즈마 샘플은 일시적 ° C 장기 저장을 위해 -20 ° C 또는 -80에 저장할 수 있습니다
- 일단 플라즈마를 수집, 혈청 무료 (불완전) RPMI 1640 미디어 (주위 온도에서)와....
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토론
설명 전체 혈액 분석은 세포 분리 및 광범위한 시료 처리 및 조작을 필요로 다른 기술에 비해보다 밀접하게 생리 조건을 모방하는 간단한 방법입니다. 이 방법은 전체 혈액의 백혈구를 계산하기 때문에, 정확하게 셀 번호에 따라 샘플을 표준화하는 방법을 제공하기 위해 AO와 Cellometer 비전을 활용합니다.
그것은이 분석을 위해, 전체 혈액은 다른 anticoagulants가 칼슘 chelators을 알고 있으므로 헤파린 나트륨 수집 튜브로 그려해야하기 때문에 분석의 결과에 영향을 미칠 수 있다고 언급되어야한다. 이 시토킨 농도에 영향을 미칠 수 있기 때문에 혈청 무료 미디어도 사용해야합니다. 또한 중요한 한 번 얻은 샘플의 즉각적인 처리됩니다. 설명한 방법은 전체 혈액을 자극하는 LPS와 ATP를 사용하여 IL - 1βconcentration, 다른 병원균과 자극이 자극에 따라 다양한 시토킨 및 케모카인 응답을 측정하는 데 사용할 수를 측정하는 반면 있지만, 자극 시간과 조건.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 연구는 관절염과 미 국립 보건원의 Musculoskeletal와 피부 질환의 국립 연구소의 교내 연구 프로그램에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Sodium Heparin 혈액 수집 튜브 | BD Biosciences | 366480 | |
| RPMI 1640 배지 | GIBCO, by Life Technologies | 21870-100 | |
| Acridine Orange | Invitrogen | A3568 | |
| Cellometer Vision | Nexcelom Bioscience | 기기 정보는 회사에 문의하십시오 | |
| Cellometer 세포 계수 챔버 | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100 | |
| 24-웰 조직 배양 플레이트 | Corning | 3524 | |
| Ultra Pure E. coli K12 LPS | Invitrogen | tlrl-eklps | |
| Adenosine 5´-tripohasphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 | |
| Bio-plex 200 시스템 | Bio-Rad | 기기 정보는 회사에 문의하십시오 | |
| Bio-Plex Pro human cytokine x-plex 어세이 | Bio-Rad | x-plex 어세이는 지정된 관심 사이토카인에 따라 맞춤 제작됩니다 |
참고문헌
- Martinon, F., Mayor, A., Tschopp, J. The inflammasomes: guardians of the body. Annu Rev Immunol. 27, 229-265 (2009).
- Thurm, C. W., Halsey, J. F. Measurement of cytokine production using whole blood. Curr Protoc Immunol. 66, 7-18 Forthcoming.
- Mariathasan, S.
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재인쇄 및 허가
