의 신경근육학 교차로 (NMJ) Drosophila melanogaster 정상적인 시냅스 기능뿐만 아니라, 특정 신경 질환에서 발견 시냅스 기능 perturbations 공부를위한 중요한 모델 시스템입니다. 우리의 해부를위한 프로토콜을 제시 Drosophila 애벌레 모터 시스템과 immunostaining.
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이 논문에서
요약
초록
Drosophila 애벌레 신경근육학 교차점 (NMJ)은 시냅스 구조와 기능 연구를위한 훌륭한 모델입니다. Drosophila 잘 강력한 유전자 조작과 애벌레 신경계가 정상 기능뿐만 아니라 공부에 특히 유용합니다 입증되었습니다뿐만 아니라 perturbations의 용이성에 대한 알려져있다 그 일부 신경 질환 (로이드와 테일러, 2010)과 함께. Drosophila에서 발견된 대부분의 주요 시냅스 분자는 또한 포유류에서 발견된 대부분의 CNS는 포유류의 시냅스를 흥분성의 같은 Drosophila NMJ은 glutamatergic하고 활동을 종속적인 리모델링을 (코 외., 2000)을 보여줍니다 수 있습니다. 자신의 innervation 패턴 그것이 가능한 이러한 모터 뉴런과 신체 - 벽 근육 섬유 사이의 것과 식별 시냅스 터미널, 그들이 신경을 분포시키다 (Keshishian와 김, 2004). 공부를하고 틀에 박힌 및 반복되기 때문에 또한, Drosophila의 뉴런은 개별적으로 확인할 수 있습니다 유전과 물리적 조작의 용이성과 함께 evolutionarily 보존 버렸네 구성 요소의 존재는 시냅스 기능 (Budnik, 1996)을 기본 메커니즘을 조사하는 Drosophila 모델이 이상적입니다.
이들은 신경 전달 물질 방출의 사이트이기 때문에 시냅스 터미널에서 활성화된 영역은 특히 관심이 있습니다. NC82은 Drosophila 단백질 Bruchpilot (Brp), 활성 영역 (Wagh 외., 2006)의 중요한 구성 요소입니다 CAST1/ERC 가족 구성원을 인식 단클론 항체이다. Brp 직접 활성 영역 T - 바 형태로 표시하고 효과적으로 칼슘 2 클러스터링에 대한 책임이 + T - 바 밀도 아래 채널 (파우켓 외., 2009).했습니다 Brp의 돌연변이 칼슘이 많이 감소 + 채널 밀도, 우울 evoked 소포 릴리스 및 변경 단기 소성 (키텔 외., 2006). 활성 영역의 변경은 Drosophila 질환 모델에서 관찰되었습니다. 예를 들어, NC82 항체를 사용하여 immunofluorescence는 활성 영역 밀도가 루게릭병과 피트 - 홉킨스 증후군 (.; Zweier 외, 2009. Ratnaparkhi 외, 2008)의 모델로 감소되었다 것으로 나타났다. 따라서 질병의 Drosophila의 애벌레 모델에 적극적으로 지역 또는 기타 시냅스 단백질의 평가는 시냅스 결함의 존재에 대한 가치있는 초기 실마리를 제공할 수 있습니다.
NMJ의 immunofluorescence 분석을 위해 전체를 마운트 해부 Drosophila의 애벌레를 준비하는 것은 몇 가지 기술이 필요하지만, 약간의 연습이 가장 과학자들에 의해 수행할 수 있습니다. 발표는 각 유전자형 사이의 환경 차이를 제한하고 재현성 및 통계 분석에 대한 자신감을위한 충분한 동물을 제공 해부와 같은 해부 접시에 immunostained하는 여러 애벌레를 위해 제공하는 방법입니다.
프로토콜
1. Immunofluorescence 준비 :
- 해부 표면을 만들려면, 작은 조직 문화 플레이트에 Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 자료를 부어. 완전히 그래서 해부 영역 림보다 낮은 것을 번호판을 작성하지 않도록합니다.
- 조작의 용이성 증가 약 3.5mm의 길이로 절개 핀을 장식하고, 유충 당 적어도 6 핀을 가지고 있는지 확인하십시오.
- 당신은 절개에 대한 핀을 파악하실 수 있습니다 무딘 집게가 필요합니다.
2. 애벌레의 해부 :
- 유리병의 측면 주위에 크롤 링하고 번데기가되다하기 시작하지 않은 셋째 instar의 애벌레를 헤매고 선택합니다.
- stereomicroscope 아래 절개 표면에 유충 놓으십시오. 멀리 Kimwipe를 사용하여 여분의 moister 윅.
- 등의 측면가 직면되도록 각각의 유충을 마련. 당신은 애벌레의 등 부분의 측면 두명 기관, 흰색 라인을 볼 수 있습니다. 이것은 지느러미 정중선을 표시하기 때문에 중간에 중심이 최대한보십시오.
- 그냥 입 갈고리 위에 플레이스 핀 # 1 (그림 1).
- 그냥 tracheae 사이 spiracles 위의 꼬리에 핀 # 2를 넣으십....
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토론
뉴런은 시냅스 터미널 면적은 매우 중요하며, 사후 및 사전 신경 세포들 간의 적절한 의사 소통을위한 다리입니다. 질환 모델에서 신경 세포의 건강을 조사하기 위해 강력한 방법은 immunofluorescence에 의해 시냅스 터미널의 단백질을 분석하는 것입니다. 여기에 제시 immunofluorescence 방법은 집단 간의 환경 차이를 제한하는 동안 연구자가 동시에 많은 애벌레를 검사 수 있습니다. Drosophila 타사 instar의 애벌레의 중추 신경 시스템은 매핑과 시냅스 터미널, 접근성, 재현성 및 유전자 조작의 능력을 반복 glutamatergic 시냅스, 등 많은 장점이 있습니다. 특히 Drosophila의 연결을 질병 모델에서 활성 영역 단백질 Bruchpilot의 수준이 변경되었습니다. 애벌레의 다수가 동시에 assayed 때문에, 제시 방법을 사용하여 활성 영역 분석은 신경 세포의 건강에 근본적인 결함을 반영 수있는 그룹 사이의 미묘한 차이를 감지하기 위해 연구자 수 있습니다.
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는이 원고에 대한 그들의 도움이 덧글에 대한 박사 Nael Alami 박사 남 김성철 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머베이스 | 다우 코닝 | 68037-59-2 | 혼합 후 느린 회전에 넣어 30 분 이상 앉아 있도록하여 천천히 상승하는 기포에 대한 수 있습니다. |
| 스테인레스 스틸 Minutien 핀 | 파인 과학 도구 | 26002-10 | 약을 낸다. 일반 가위로 길이 3 ~ 4mm짜리 |
| Laminectomy의 집게 (핀 쥐고위한 블런트 - 사용) | 파인 과학 도구 | 11223-20 | 핀 쥐고에 대한 무딘 포셉로 사용 |
| 해부의 포셉 | 세계 정밀 계측기 | 501985 | |
| 극상의의 Vannas 가위, 길이 8cm | 세계 정밀 계측기 | 501778 | |
| 마우스 방지 Brp 항체 | DSHB | NC82 | 1시 50분 희석을 사용 |
| Cy3 Affinipure 고앗 방지 양고추냉이 퍼옥시데이즈 | 잭슨 Immunoresearch | 123-165-021 | 1:200 희석에서 사용 |
| 알렉사 플루어 488 염소 안티 - 마우스 IgG | Invitrogen | A11001 | 약 사용합니다. 1:200 희석 |
참고문헌
- Budnik, V. Synapse maturation and structural plasticity at Drosophila neuromuscular junctions. Curr Opin Neurobiol. 6, 858-867 (1996).
- Fouquet, W., Owald, D., Wichmann, C., Mertel, S., Depner, H., Dyba, M., Hallermann, S., Kittel, R. J., Eimer, S., Sigrist, S. J. Matura....
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재인쇄 및 허가
