우리는 Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 배아 줄기 (ES) 세포에서 염색질 단백질 역학을 모니터 (플립) Photobleaching에서 형광 손실을 포함하여 photobleaching 방법을 설명합니다. 염색질 소성을 연구하는 방법 중 하나가 될 것으로 간주됩니다 염색질 단백질 역학은, pluripotent 세포 향상됩니다.
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방법 논문
배아 줄기 세포 생활에서 염색질 단백질 역학을 측정하는 Assays (FRAP 및 플립)를 Photobleaching
이 논문에서
요약
초록
Photobleaching 후 형광 복구 (FRAP)와 Photobleaching에서 형광 손실 (플립)는 좋은 공간과 시간적 해상도를 가진 살아있는 세포의 단백질 역학 연구를 활성화합니다. 여기 FRAP 및 마우스 배아 줄기 (ES) 세포에 H1과 HP1 포함 염색질 단백질의 플립 assays을 수행하는 방법에 대해 설명합니다. FRAP 실험에서 세포는 녹색 형광 단백질 (GFP) 또는 그에 파생 상품 (YFP, CFP, 체리 등) 융합 관심의 단백질과 중 transiently 또는 안정, transfected 있습니다. transfected, fluorescing 세포에서 강렬한 초점 레이저 빔을 관심의 비교적 작은 영역 (ROI)을 표백제. 레이저 파장은 융합에 사용되는 형광 단백질에 따라 선택됩니다. 레이저 빛이 irreversibly 투자 수익 (ROI)에있는 분자의 형광 신호를 표백제와 즉시 표백 다음, 표백 영역에서 형광 신호의 복구 - 표백하지 않은 분자와 표백 분자의 교체에 의해 중재가 - 시간 저속 이미징을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 생성된 형광 복구 곡선은 단백질의 이동성에 대한 정보를 제공합니다. 형광 분자가 고정되어있다면, 어떤 형광 복구 관찰되지 않습니다. 보완적인 접근에서, Photobleaching에서 형광 손실 (플립)은 레이저 빔을 반복 같은 자리를 표백제와 신호 강도가 다른 fluorescing 세포 단위로 측정됩니다. 뒤집기 실험 따라서 오히려 형광 복구보다 신호 부패를 측정하고 세포 구획 사이 였죠 단백질의 이동성뿐만 아니라 단백질을 확인하는 데 유용합니다. 과도 바인딩은 염색질 결합 단백질의 일반적인 속성입니다. 각 염색질 단백질의 주요 분율이 일정한 상태에서 특정 순간에 염색질에 바인딩되어 있지만, 바인딩은 일시적이며 대부분의 염색질 단백질 초의 순서에 체류 시간, 염색질에 대한 높은 매출 있습니다. 이러한 속성은 게놈의 표현 1 높은 소성을 생성하기위한 열쇠입니다. 염색질 단백질 (heterochromatin 단백질 1 (HP1), 링커 히스톤 H1 및 핵심 histones 포함)의 동적 교환이 높습니다 어디 Photobleaching 실험 따라서 특히 ES 세포에서 염색질 구조 단백질 GFP - 퓨전 버전을 사용 염색질 소성을, 결정하기 위해 특히 유용합니다 2,3 차별화된 세포보다.
프로토콜
1. ES 세포를 도금
T = 0 시간
MEF 도금
- 문장 라이브 영상 μ - 슬라이드 8 자 (ibidi, 뮌헨, 독일) 젤라틴이나 chambered 커버 안경에서 (연구실 - 테크, 로체스터, NY) 또는 유리 바닥 문화 요리 (MatTek, 애쉬, MA). 50-30 분두고 무료 젤라틴 멀리 대기음.
- 시드 22,000 MEFs / 잘 DMEM 250 μl 총 볼륨의 [10% 태아 소 혈청 (FBS)와 보충]. 세포 조직 문화 인큐베이터 (37 ° C 5 % CO2)의 성장을 허용합니다.
T는 = 6 시간
ES 세포 도금
- 기음 DMEM.
- 종자는 / 잘 ES 세포 미디어 250 μl 총 판매량 15,000 R1 세포와 잘 코팅 각 MEF은 [10% ESC 등급 태아 소 혈청 (FBS), 1 MM 나트륨 pyruvate, 0.1 MM 불필요한 아미노산, 0.1 MM의 β -와 보충 메르 캅 토 에탄올, 1000 U / ML 백혈병 억제 인자 (난생)], 다음날 30 % 50% 합류를 얻을 수 있습니다.
2. ES 세....
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토론
세포 집단 또는 고정 세포, FRAP 실험에서 정화 염색질을 포함 대부분의 사용 가능한 기술과 달리 살아있는 세포에서 염색질 단백질 역학의 변화를 따릅니다. 우리는 염색질 단백질 역학 염색질 소성 좋은 지표가된다는 것을 발견. 그러나, 그것이 융합에게 GFP와 관심의 유전자를 필요로하기 때문에, 형광 태그의 추가는 단백질의 기능을 방해할 수 있습니다. 따라서, 사전 FRAP 진행하는 융합 단백질이 엄격하게 그것의 네이티브 대응과 같은 속성과 기능을 보장하기 위해 테스트해야합니다. 골드 표준 녹아웃 셀 라인에서 GFP - 융합과 내생 단백질의 기능을 보완하는 것입니다. 그러나, 녹아웃 셀 라인은 항상 사용할 수 없습니다 많은 경우에 단백질의 부재는 분명 표현형이 없습니다. 그럼에도 불구하고, 하나는 적절한 부분 교환을 보장하기 위해 내생 단백질에 비해 모든 융합 단백질의 subcellular 배포, 자사의 표현 수준의 바인딩 파트너를 테스트할 수 있습니다.
일단 확인, GFP .......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
우리는 중요한 의견과 매일 문제 해결 photobleaching 실험, 특히 Meshorer 연구실의 구성원, 샤이 Melcer, 안녕 Alajem, Edupuganti Raghu RAM, Badi 스리랑카 Sailaja, 애나 Mattout 및 알바 비란 감사드립니다. EM은 조셉 H. 및 벨 R. 브라운은 생명 과학의 수석 강사이며, 이스라엘 과학 재단 (ISF 943/09), 건강의 이스라엘 교육부 (6007) 유럽 연합 (IRG - 206872 및 238176)에 의해 지원됩니다 이스라엘 암 연구 재단, 히브리어 대학과 이스라엘 Psychobiology 연구소의 내부 Applicative 의료 기금.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | |
| DMEM | 시그마 | D5671 | |
| 젤라틴 | 머크 | 1.04078 | |
| Opti - 멤 | Gibco | 31,985 | |
| 대중 교통 - LT1 | Mirus | MIR2300 | |
| μ - 슬라이드 8 - 잘 | ibidi | 80,826 |
참고문헌
- Phair, R. D. Global nature of dynamic protein-chromatin interactions in vivo: three-dimensional genome scanning and dynamic interaction networks of chromatin proteins. Mol Cell Biol. 24, 6393-6402 (2004).
- Meshorer, E.
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재인쇄 및 허가
