Summary
Biz video intraluminal monofilament kullanarak yetişkin farelerde orta serebral arter oklüzyonu üretmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Ayrıca beyin enfarktüsü ölçüde 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile boyanarak tarafından nasıl değerlendirileceğini gösterir.
Abstract
İnme, Amerika Birleşik Devletleri'nde 1 en sık rastlanan ölümcül bir nörolojik hastalıktır . Beynin kan damarlarının tıkanması (iskemik inme) 2 vuruş çoğunluğu (% 88) sonucudur. En iskemik inme (~% 80) orta serebral arter (MCA) 3 topraklarında meydana gelen bu yana, birçok hayvan zamanlı modeller geliştirilmiştir Bu arter üzerinde odaklanmıştır. Orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) intraluminal monofilament modeli ekleme ve eksternal karotid artere cerrahi filament ucu MCA kökeni tıkar kadar bırakma, internal karotis arter (ICA) öne parçacığı içerir kan akımı ve MCA topraklarında 4 sonraki beyin enfarktüsü. Tekniği, kalıcı ya da geçici oklüzyon 5 modeli için kullanılabilir . Dikiş, belli bir zaman aralığında (30 dakika, 1 saat veya 2 saat) sonra kaldırılırsa, reperfüzyon (geçici MCAO) elde edilir; filament yerinde bırakılırsa (24 saat) işlem kalıcı MCAO bir model olarak uygundur. . Bu teknik kraniektomi, kafatasının bir kısmının, intrakranial basınç ve sıcaklık 6 etkileyebilir kaldırmak için bir nöroşirürji prosedür gerektirmez. Bu kalıcı ve geçici fokal serebral iskemi, sıçan ve fareler 7,8 taklit etmek için en sık kullanılan yöntem haline gelmiştir . Beyin enfarktüsü ölçüde değerlendirmek için, iskemik beyin dokusu 9 tanımlamak için 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) ile beyin dilimleri leke. Bu video, MCAO TTC boyama yöntemi ve infarkt belirlenmesi göstermektedir.
Protocol
1. MCAO Yöntemi
Bu protokol, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından deney hayvanlarının kullanımı için sağlık kuralları Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komiteleri UCSF ve Kent State Üniversitesi ve uymaktadır tarafından onaylandı.
- 5-0 monofilament sütür (Harvard Apparatus, Holliston, MA) 20 mm parça halinde kesin. Cauterizer (Braintree Scientific, Inc, Braintree, MA) yakınında ısıtma ile her segmentin ucu yuvarlak. Mikrometre (Uygulamalı Resim Inc, Rochester, NY) kullanarak ucu çapı ölçün. Biz bir fare için 0,21-0,22 mm 25-30 g vücut ağırlığı ile son bir ucu çapı bir sütür
- Tüm cerrahi aletler sterilize otoklav (en az 121 ° C, 15 dakika için 15 PSI). % 70 etanol kullanılarak ameliyat masa ve ilgili ekipman dezenfekte edilmelidir.
- 8-12 hafta eski bir fare (25-30 g) anestezisi% 5,% 30 O 2 / (Aerrane, Baxter, Deerfield, IL) izofluran% 70 N 2 V-10 Anestezi sistemi kullanarak O (VetEquip, Inc . Pleasanton, CA). Anestezi indüksiyonundan sonra, izofluran düzeyini azaltmak ve% 1.5 olarak sürdürmek.
- Fareyi bir ısıtma yastığı yatar pozisyonda yerleştirin. Rektal prob yerleştirin ve izlemek ve korumak 36,5-37,5 arasında vücut ısısı ° C ile TR-200 homeothermic sıcaklık sistemi (Güzel Bilim Araçlar A.Ş., Foster City, CA).
- Tıraş ventral boyun bölgesinde cilt maruz elektrik kesme makineleri (Braintree Bilimsel) kürk. % 70 etanol üç uygulamaları kullanarak cerrahi bölge dezenfekte edin.
- Stereo bir diseksiyon mikroskobu altında (Nikon, Japonya), boyun 1 cm uzunluğunda orta hat kesi yapmak. Retraktörler (Braintree Bilimsel) cerrahi alanında ortaya çıkarmak ve sağ karotis arter (CCA), eksternal karotid arter (ECA) ve internal karotis arter (ICA) tanımlamak için kullanın. Dikkatle, sinirler ve fasya çevreleyen ücretsiz arterler disseke.
- ECA daha distalde inceleyin ve bipolar koagülatör (Howard Instrument Inc Tuscaloosa) kullanarak ECA ve üstün tiroid arter (STA) şube koagüle. ECA ve STA pıhtılaşmış segmentinde kesin.
- ECA güdük etrafında gevşekçe iki 8-0 ipekle bağlar. ECA ve ICA CCA çatallanma bir vasküler klemp (Güzel Bilim Araçları) uygulayın.
- Vannas tarzı yaylı makas (Güzel Bilim Araçları) ECA güdük sonunda küçük bir kesi olun. 5-0 monofilament sütür ucunda yuvarlak bir uzunluğunu ölçün ve kaydedin. Kesi dikiş takın ve kelepçe ilerlemek. Lümen etrafında iki ipekle yaşayan monofilament sütür hareketliliği güvenli ama korumak için yeterli sıkın.
- Bifurkasyon kelepçeyi çıkarın. 9-10 mm, MCA kökeni kapamak için CCA bifurkasyon ötesinde bir mesafe için hafifçe ICA ECA lümen monofilament sütür ilerlemek. Ameliyat süresi yaklaşık 30-45 dk.
- Boyun insizyonu sütür ve anestezi kurtarmak ve kafesine geri dönmek için 35 ° C hemşirelik kutu fare. Genellikle anestezi kurtarmak için fareler için 5-10 dakika sürer. Geçici MCAO gerçekleştirmek için, araştırmacı, genellikle arasında 0.5-2 saat fareyi yeniden uyutmak ve ECA güdük bir süre sonra geri dikiş geri
- MCAO indüksiyonu Yirmi dört saat sonra,% 5 izofluran fare uyutmak ve servikal dislokasyon euthanize. Fare başını kesmek ve beyin toplamak. Koronal beyin buz üzerinde bir beyin matriks (Braintree Bilimsel) 2-mm dört dilimler halinde dilimleyin. % 2 beyin dilimleri için 1X PBS içinde 20 dakika oda sıcaklığında 2,3,5-triphenyltetrazolium klorür (TTC) (Sigma-Aldrich) enfarktüsü boyutunu ve kapsamını belirlemek üzere inkübe edin. Görüntüleme kadar nötr 4 tamponlu formalin solüsyonu (Sigma-Aldrich)% 10 oranında beyin dilimleri ° C sabitleyin. Infarktüsü ölçüde vallahi protokol 955 (açıklandığı gibi sayısal http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=955 ) 9.
2. Temsilcisi Sonuçlar
MCAO tarafından oluşturulan infarktlar striatum ve dorsolateral korteks görülür. Striatum serebral korteks daha iskemi daha duyarlı. MCAO fazla bir saat hem striatum ve kortekste zarar verecek MCAO Otuz dakika, striatum sadece bir infarkt üretecektir. Sonra, toplam infarkt yüzde 24 saat kalıcı MCAO ~ 40 ± yarımküreye ve ameliyat sonrası ölüm oranı% 5 ~% 10. Ameliyat sırasında aşırı kanama meydana gelirse, Biz ileri çalışmalar fareler hariç, işlem süresi 90 dakika aştığı, fare, 15 dakika içinde anestezi kurtarmak için başarısız olursa, ya da kanama, beyin dilimleri ya da postmortem muayene sırasında Willis daire üssünde bulunan .
61/2761fig1.jpg "alt =" Şekil 1 "/>
24 saat sonra kalıcı MCAO TTC-lekeli beyin kesitleri Şekil 1 Temsilcisi görüntüler (koronal seviye 1-4). Nekrotik alanlarda böyle bir enzimatik aktivite yokluğu nedeniyle beyaz kalırken yaşayan doku TTC enzimatik, kırmızı renkli 1,3,5-triphenylformazan (TPF), dehydrogenases tarafından azaltılır. Bu nedenle, enfarktüs alanı TPF için TTC dönüşüm eksikliği nedeniyle beyaz renk ile tespit edilebilir. Not: TTC biraz ısı ve ışık, ısı ve mümkün olduğunca hafif boyanan kesitler korumak kararsız.
Discussion
Farelerde MCAO genellikle insanlarda fokal beyin iskemi modeli için kullanılır. Inme çalışmaları için farelerin kullanın çünkü transgenik ve nakavt suşlar durumu daha sık olmuştur. Protokolünde dikkat edilmesi gereken bir kaç kritik ayrıntılar vardır:
- Bu, ameliyat sırasında fare vücut ısısını korumak için gereklidir ve tam anestezi kurtarır önce. Vücut ısısı infarktüsü ölçüde etkileri vardır; hipotermi azalır ve hipertermi infarkt boyutunu artırır.
- Teşhir ve CCA ve ECA izole ederken, infarkt büyüklüğü ve düşüş canlılığı artırabilir yakındaki vagus siniri ve trakea, zarar görmesini önlemek.
- 10 mm'den fazla çatallanma geçmek monofilament sütür sokmayın. Çok uzakta takılı bir dikiş, beyin kanaması, anterior serebral arter ve sonuç delebilir. Bir direnç dikiş yaklaşık 9-10 mm çatallanma noktanın ötesinde gelişmiş hissedilebilir. Eğer bu olursa, araştırmacı dikiş ilerleyen durdurmak ve mesafe onaylamak gerekir.
Disclosures
Biz ifşa etmek için herhangi bir potansiyel çatışan çıkarları yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma NIH hibe NS057195, UCSF REAC ödül, ve Kent State Üniversitesi, start-up WH Chou fonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | Chemical | Baxter Internationl Inc. | 95045-588 | |
| V-10 Anesthesia system | Equipment | VetEquip | 901807 | |
| TR-200 Temp Controller | Equipment | Fine Science Tools | 21060 | |
| Electric clipper | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | CLP-9931 | |
| Dissecting microscope | Equipment | Nikon Instruments | SMZ745T | |
| Retractor system | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | ACD-014 | |
| Bipolar coagulator | Equipment | Howard Instrument | 64000 | |
| Silk suture | Material | Harvard Apparatus | 510479 | |
| Monofilament suture | Material | Harvard Apparatus | 723351 | |
| Vascular clamp | Equipment | Fine Science Tools | 00396-01 | |
| Vannas scissor | Equipment | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Brain matrix | Equipment | Braintree Scientific, Inc. | BS-2000C | |
| 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride | Chemical | Sigma-Aldrich | T8877 | |
| 10% neutral buffer formalin | Chemical | Sigma-Aldrich | HT5011 |
References
- Howard, G., Howard, V. J. Distribution of stroke: hetrogeneity of stroke by age, and sex. , Elsevier Inc. New York. 3-12 (2004).
- Thom, T. Heart disease and stroke statistics--2006 update: a report from the American Heart Association Statistics Committee and Stroke Statistics Subcommittee. Circulation. 113, e85-e151 (2006).
- Mohr, J. P. Middle cerebral artery disease. , Elsevier Inc. New York. 123-166 (2004).
- Longa, E. Z. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20, 84-91 (1989).
- Chou, W. H. Neutrophil protein kinase Cdelta as a mediator of stroke-reperfusion injury. J. Clin. Invest. 114, 49-56 (2004).
- Hudgins, W. R., Garcia, J. H. The effect of electrocautery, atmospheric exposure, and surgical retraction on the permeability of the blood-brain-barrier. Stroke. 1, 375-380 (1970).
- Carmichael, S. T. Rodent models of focal stroke: size, mechanism, and purpose. NeuroRx. 2, 396-409 (2005).
- Durukan, A., Tatlisumak, T. Acute ischemic stroke: overview of major experimental rodent models, pathophysiology, and therapy of focal cerebral ischemia. Pharmacol. Biochem. Behav. 87, 179-197 (2007).
- Taniguchi, H., Andreasson, K. The hypoxic-ischemic encephalopathy model of perinatal ischemia. J Vis Exp. , (2008).
