Summary
이 동영상은 포르말린 고정 파라핀 - - 임베디드 물질로부터 DNA 추출을위한 프로토콜을 보여줍니다. 이것은 조직 섹션 크실렌과 deparaffinized하는 멀티 일 절차, 에탄올과 rehydrated 이후 유전자의 특정 또는 게놈 차원의 분석을 위해 DNA를 정화하고 분리 proteinase K로 처리됩니다.
Abstract
질병 개발 및 진행은 염색체 rearrangements, 복사 번호 이득과 손실과 DNA의 methylation을 포함하여 자주 유전 및 epigenetic aberrations 특징으로하고 있습니다. 같은 microarrays으로 높은 처리량, 게놈 - 광범위한 프로 파일링 기술, 발전이 크게 이러한 특정 변경을 파악하고 감지하는 능력을 향상. 기술 향상을 위해 계속하지만 같은 제한 요인은 샘플의 품질 및 가용성 유지됩니다. 또한, 후속 임상 정보와 질병 결과는 종종 년 초기 표본 수집 후에 수집하고 있습니다. 표본은, 일반적으로 포르말린 고정과 파라핀 - 임베디드 (FFPE)는 수십 년 동안 병원에 아카이브에 저장됩니다. 추출의 적절한 방법이 적용되는 경우에는 DNA가 효과적이고 효율적으로 파라핀 - 임베디드 표본에서 복구할 수 있습니다. 제대로 보존 및 저장 표본에서 추출한 고품질의 DNA는 유전 및 epigenetic 서명 1 정상과 질병 조직과 세대의 비교에 대한 양적 assays을 지원할 수 있습니다. 파라핀 - 임베디드 샘플, 조직 코어 또는 microdissected 조직에서 DNA를 추출하려면 조직에서 파라핀을 녹이고 크실렌 치료에 받게 다음 에탄올 세척 일련의를 사용하여 rehydrated 있습니다. 단백질과 같은 nucleases와 같은 유해 효소 이후 proteinase K. 같은 나트륨 dodecyl 황산 (SDS)로 denaturing 요원을 포함하고 소화 2 용이하게 용해 버퍼의 또한으로 소화하고 있습니다. 핵산은 biphasic 솔루션을 생성 버퍼 포화 페놀 및 고속 원심 분리를 사용하여 조직 lysate에서 정화 수 있습니다. 단백질, lipids과 다당류가 간 및 유기 - 단계 각각에 분리된있는 동안 DNA와 RNA는 위 수성 단계에 남아 있습니다. 수성 단계 반복 페놀 extractions의 보존 깨끗한 샘플을 생성합니다. 페놀 extractions 후, RNase가 오염 RNA를 제거하는 추가됩니다. 추가 페놀 extractions는 RNase와 부화 다음은 남아있는 효소를 제거하는 데 사용됩니다. 아세트산 나트륨과 이소프로판올 precipitates DNA, 그리고 고속 원심 분리의 추가는 펠렛으로 DNA를 사용하고 이소프로판올 제거를 용이하게합니다. 강수량에서 이월된 초과 소금은 이후 효소 assays를 방해할 수 있지만, 다시 펠렛으로 DNA 세 원심 분리 다음에, 70 % 에탄올로 세척하여 DNA에서 제거할 수 있습니다. DNA는 증류수 또는 선택의 버퍼에 다시 정지 계량 및 -20 ° C.에 저장됩니다 정화의 DNA가 이후에 포함할 스트림 응용 프로그램에서 사용할 수 있지만 여기에 국한되지 않습니다, PCR, 배열 비교 게놈의 하이브리드화 4 (배열 CGH), methylated DNA를 Immunoprecipitation (MeDIP)과 조직 / 종양 샘플의 통합 분석 있도록 시퀀싱.
Protocol
Discussion
histopathologic 분석과 진단을 위해 Biopsied 또는 수술 excised 조직은 장기 저장을 위해 자주 포르말린 고정과 파라핀 임베디드 (FFPE)입니다. 질병의 유전 기초를 이해 증가 흥미를 가지고,이 샘플에서 DNA를 추출하는 능력은 게놈 분석과 translational 연구에 사용할 수있는 진단 자료의 귀중한 소스를 나타냅니다. 핵산은 크게 6 연결 단백질 핵산 및 단백질 - 단백질 상호 수정할 수 있습니다와 같은 역사적 FFPE 샘플은 분자 분석을 위해 가능한 원본으로 간주되지 않았습니다. 그러나, 테아제 소화가 PCR, 배열 CGH, 시퀀싱 및 methylation 프로 파일링 포함하여 하류 분석에 적합합니다 조각난 핵산을 출시하는 발견은 유전자 분석 6이 귀중한 표본의 사용이 가능합니다.
파라핀 - 임베디드 조직에서 DNA를 추출 DNA를 정화 차동 용해도에 의존 강력한 절차입니다. 추출된 DNA 품질 및 수량과 이후의 DNA를 증폭의 성공은 추출 과정과 전후의 매개 변수의 수에 따라 다릅니다. 이들을 포함 하나 이에 국한되지 않습니다 조직의 종류와 금액은, 조직 보존에 사용되는 정착액의 종류, 고정 기간, 파라핀 블록 및 스토리지 조건의 나이뿐만 아니라 원하는 DNA 세그먼트의 길이는 수 1,7를 증폭. 소화 되 다만 파라핀이 좋지 샘플의 품질과 PCR 증폭의 억제로 연결 같은 조직에서 파라핀 제거가 성공적으로 추출을위한 가장 중요한 단계입니다.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는 그들의 평가 및 본 동영상과 문서의 critiques에 대한 람 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 건강 연구에 대한 캐나다 연구소에서 자금을 지원했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Xylene | VWR international | CABDH6216- 4 | - |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | - |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet International | C0160-B | - |
| Lysis Buffer | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
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| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher Scientific | BP1750I-400 | - |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher Scientific | BP1752I-400 | - |
| RNase A | Roche Group | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
||
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | - | - |
References
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of 'masked' proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. oseph, R, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
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- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
