Summary
Este artigo descreve vários procedimentos para ratos e camundongos de triagem para detectar endo-ou ectoparasitism. Vários ensaios de diagnóstico será demonstrado, tanto os adequados para uso de animais vivos e aqueles usados após a eutanásia do animal. Fotografias para auxiliar na identificação de parasitas ratos e camundongos serão incluídos.
Abstract
Parasitas internos e externos continuam a ser uma preocupação significativa em instalações de roedores de laboratório, e instalações de pesquisa muitas porto alguns animais parasitados. Antes de embarcar em um exame de animais para parasitas, duas coisas devem ser consideradas. Um: o uso será feito das informações coletadas, e dois: que teste é o mais adequado. Sabendo que os animais são parasitados pode ser algo que a instalação aceita, mas muitas vezes há a necessidade de tratar os animais e, em seguida, para determinar a eficácia do tratamento. Parasitas podem ser detectados em animais através de várias técnicas, incluindo amostras colhidas em animais vivos ou mortos. Historicamente, os testes com maior sensibilidade diagnóstica necessária a eutanásia do animal, apesar de PCR tem permitido testes de alta sensibilidade para vários tipos de parasita. Este artigo demonstra os procedimentos para a detecção de endo e ectoparasitas em camundongos e ratos. Os mesmos procedimentos são aplicáveis a outros roedores, embora as espécies de parasitas encontrados serão diferentes.
Protocol
1. Endoparasitos exame (Tabela 1)
1. Teste de fita perianal (ver também a secção 5, estes são normalmente realizados ao mesmo tempo)
- Retire um pedaço de clara, não fosco, fita de celofane de um distribuidor. A fita deve ser longa o suficiente para lidar por uma extremidade, sem tocar no meio (aproximadamente 5 cm). Pode ser mais fácil para dispensar vários comprimentos de uma só vez, anexando-os à beira de uma superfície de trabalho limpa e usar quando necessário.
- Levante um rato de sua gaiola e coloque sobre a tampa da gaiola, segurando-o pelo rabo. Executar esta ação em uma câmara de fluxo laminar ou gabinete de biossegurança se o estado de saúde do animal exige.
- Contenha o rato pela cauda, levantando as patas traseiras da jaula. Segure a extremidade da fita entre o polegar eo indicador, em seguida, aplicar o meio da fita firmemente ao períneo o rato, incluindo a área perianal várias vezes. O cabelo deve ser visto para ser aderente a fita para o teste seja considerado bem sucedido.
- Coloque a parte traseira do rato na gaiola.
- Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina de vidro escrito limpo, aplicar a fita para o slide, e depois outra gota de óleo mineral. Cubra com uma lamínula de vidro.
- Leia a lâmina de microscópio com objetivas 10x e 40x em um microscópio de luz. O teste de fita perianal é melhor na detecção de ovos Syphacia, embora outros ovos do parasita são encontrados às vezes.
2. De flutuação fecal
- Montar solução de flutuação, um frasco de fundo chato (frasco de pílulas ou dispositivo de flutuação fecal como Ovatector), placa de Petri, lamínula, lâmina de microscópio e aplicador / sticks mexendo. Solução de flutuação, como Fecasol, deve ter um peso específico de 1,20-1,30 e pode ser feita a partir de vários sais de sódio, açúcar, sulfato de zinco, ou adquiridos comercialmente. (Tabela 2)
- Coletar 2-5 pelotas fecais da gaiola ou fresco do animal (s) na câmara de flotação. Se as fezes estão extremamente seco, seja devido à idade ou espécies produzindo a matéria fecal, umedecendo as fezes com 500 mL de solução salina 0,9% pode ser benéfico.
- Coloque o frasco na placa de Petri para proteger a superfície de trabalho do excesso de fezes dissolvidas. Adicionar um pequeno volume de meio de flutuação e mash e mexa bem. Sem grandes pedaços de material deve permanecer. Continuar a adicionar médio de flutuação até formar uma menisco acima da borda do frasco.
- Coloque a lamínula sobre o menisco e incubar à temperatura ambiente por 15 minutos. Ovos do parasita e alguns oocistos protozoário vai subir até o topo e aderir à lamínula.
- Após a incubação, elevador e inverter a lamínula. Coloque a lamínula sobre uma lâmina de vidro.
- Examine o slide usando os objetivos de 10x e 40x em microscópio de luz.
- Embora de baixa tecnologia e fácil de executar, em geral, esta técnica não é recomendada para camundongos ou ratos. Como regra, é mais adequado para animais que produzem um maior volume de fezes.
3. Concentração fecal e centrifugação
- Montar solução de flutuação, tubo de ensaio, lamínula, lâmina de microscópio e aplicador / sticks mexendo e tampas de tubo. Solução de flutuação deve ter um peso específico de 1,18-1,30 e pode ser feita a partir de vários sais de sódio, açúcar, sulfato de zinco, ou adquiridos comercialmente. (Tabela 2)
- Coletar 10/02 pelotas fecais da gaiola ou fresco do animal (s) em um tubo de coleta. Se as fezes estão extremamente seco, seja devido à idade ou espécies produzindo a matéria fecal, umedecendo as fezes com 500 mL de solução salina 0,9% ou com a solução de flutuação que você está usando pode ser benéfica.
- Mix de amostra em uma solução de flutuação apropriado dentro de um tubo de centrífuga de vidro. Agitação mecânica com um vortexer pode ser usado para misturar amostras. Se um vortexer é usado, snap caps devem ser colocadas nos topos do tubo para evitar derramamento e contaminação cruzada. Rotineiramente, as amostras são preparadas em 1,18 sulfato de zinco gravidade específica, no entanto outras soluções podem ser utilizadas em adição (em um tubo de preparação separada), ou em substituição.
- Adicionar solução de flutuação adicional para cada tubo para formar um menisco ligeiramente positiva em cada tubo. Aplique uma lamínula de plástico a cada tubo, e assegurar que o contato pleno com lábio tubo é feita. Coloque o tubo (s) na centrífuga.
- Centrifugar a aproximadamente 616-760 RCF por 10 minutos. Se lamínulas são perdidos ou quebrados durante o processo de centrifugação, uma lamínula novo pode ser colocado no tubo de amostra eo tubo pode ser levemente inclinada de modo que o menisco toca a lamínula novo. Sem centrifugação adicional é necessária.
- Remova a tampa deslizar de tubo de centrífuga e coloque em uma lâmina de microscópio rotulada, limpar o vidro. Se as soluções centrifugação múltiplos foram utilizados para avaliar uma amostra fecal, duas lamínulas podem ser colocados no mesmo slide.
- Mancha o slide com iodo. Isto permite uma eAsier identificação de cistos.
- Examine o slide usando objetivas 10x e 40x em um microscópio de luz.
4. Exame direto do intestino por helmintos e protozoários
- Posicione o mouse sacrificados ou carcaça de rato em decúbito dorsal em uma placa de dissecação limpa ou superfície de trabalho similar.
- Utilizando uma pinça, levante a parede abdominal na área genital. Com uma tesoura, cuidadosamente inciso parede abdominal ventral da área genital para a base da caixa torácica de remover a pele e músculo e expondo os intestinos. Remova os intestinos, começando no duodeno (segmento do intestino início na saída do estômago) e continuando até o cólon descendente (o segmento do intestino, que termina no ânus e, geralmente, contém fezes formadas).
- Intestinos lugar em uma placa de Petri 100 ml. Coletar uma porção do duodeno e ceco do animal sacrificado e coloque em um tabuleiro de dissecação. Inciso cada segmento intestinal longitudinalmente para expor a mucosa.
- Com uma tesoura, cortou os intestinos restante em pequenos troços. Adicionar água suficiente para tocar o prato para mal submergir o tecido coletado.
- Incubar a mistura da amostra a 35-40 ° C em um forno de laboratório ou incubadora para um mínimo de 10 minutos. Isto irá liberar e expor helmintos luminal. Enquanto a amostra é incubada, executar os passos seguintes.
- Coloque duas gotas de soro fisiológico 0,9% lado a lado em um único slide rotulados, para permitir a preparação de amostras a partir de dois segmentos intestinais (duodeno e ceco).
- Calor e frio esterilizar um loop inoculação ou equivalente.
- Raspar a mucosa do duodeno e coloque o raspado no lado esquerdo do slide (lado mais próximo da borda fosco).
- Raspar a mucosa do ceco e coloque a raspa de no lado direito do slide.
- Top da raspados com uma lamínula. Examine slides preparados usando a objetiva de 40x em um microscópio de contraste de fase); ampliação aumentar conforme necessário para a identificação. Se os parasitas sejam detectados, identificar com base na morfologia.
- O conteúdo prato estará pronto para exame por este ponto. Examinar o conteúdo prato sob um microscópio de dissecação. Use uma sonda ou aplicador quanto necessário para mover o conteúdo dentro do prato para concluir uma análise aprofundada. Se pinworms estão presentes eles aparecerão como pequenas, brancas, cabelo-como worms. Se tapeworms estão presentes, eles aparecerão como segmentado, worms plana (maior do que o pinworms fio-like).
- Se helmintos são detectados ou suspeitos, coletar a amostra com um pequeno par de fórceps.
- Monte o espécime em uma lâmina de vidro rotulados, limpos em uma gota de óleo de parafina ou mineral e coloque uma lamínula sobre a amostra. Examine o slide usando objetivas 10x e 40x em um microscópio de luz.
2. Ectoparasita exame (Tabela 3)
5. Fur colher exame de ectoparasitas (teste de fita)
- Retire um pedaço de clara, não fosco, fita de celofane de um distribuidor. A fita deve ser longa o suficiente para lidar por uma extremidade, sem tocar no meio (aproximadamente 5 cm). Pode ser mais fácil para dispensar vários comprimentos de uma só vez, anexando-os à beira de uma superfície de trabalho limpa e usar quando necessário.
- Levantar um mouse ou rato de sua gaiola e coloque sobre a tampa da gaiola, segurando-o pelo rabo. Executar esta ação em uma câmara de fluxo laminar ou gabinete de biossegurança se o estado de saúde do animal exige.
- Contenha o rato ou o rato. Segure a pele com hemostats e gentilmente arrancar pêlo da região escapular do mouse, região cervical ventral, região axilar, região inguinal, e alcatra dorsal. Coloque o fur na fita. O cabelo deve ser visto para ser aderente a fita para o teste seja considerado bem sucedido. Posicione o mouse ou rato de volta em sua gaiola.
- Coloque uma gota de óleo mineral em uma lâmina de vidro escrito limpo, aplicar a fita, em seguida, mais uma gota de óleo mineral. Cubra com uma lamínula de vidro.
- Leia a lâmina de microscópio com objetivas 10x e 40x em microscópio de luz.
- Este exame é melhor para detectar ácaros de pele, tais como Radfordia, Myobia e Myocoptes.
6. Raspar a pele
- Montar os seguintes materiais: animal a ser testado, óleo mineral, lâmina de microscópio, lamínulas, bisturi e tesoura. Se este teste deve ser realizado em animais vivos, devem ser anestesiado antes de começar.
- Amostra do dorso perto da base da cauda e região temporal da cabeça. Alternativamente, lesões de pele e / ou outros sites podem ser raspados.
- Profundamente raspar a pele com a lâmina de bisturi no sentido oposto do crescimento do cabelo, a corroer a epiderme. Aparando o pêlo antes da raspagem pode melhorar a sensibilidade de triagem, reduzindo a obstrução visual (excesso de pêlos) naslide.
- Coloque uma gota de óleo no slide. Aplicar a amostra para a gota de óleo limpando a lâmina (com amostra em anexo) sobre a superfície da lâmina. Adicione o óleo adicional para o slide, se necessário, e cubra com uma lamínula.
- Leia a lâmina de microscópio com objetivas 10x e 40x em microscópio de luz.
- A raspagem da pele é geralmente usado para detectar Demodex (e fungos dermatófitos).
7. Exame direto da pelagem
- Posicione o mouse eutanásia ou o rato sobre o estágio de um microscópio de dissecação.
- Examine os cabelos da pele em cerca de 10 vezes usando um aplicador ou instrumento similar a uma parte do cabelo e observar a base da haste capilar.
- Examinar a região craniana, entre os olhos eo pinas, entre as orelhas, entre as escápulas, sob o queixo, e as áreas inguinal e axilar. Alternativamente, toda a carcaça pode ser examinada.
- Recolher qualquer ectoparasitas ou material suspeito visto usando um pequeno par de fórceps. Ectoparasitas podem freqüentemente se parecem com caspa ou um acúmulo de cera amarela na base de um fio de cabelo ou diretamente sobre a pele.
- Monte o espécime em uma lâmina de vidro limpa em uma gota de óleo de parafina ou mineral e coloque uma lamínula sobre a amostra. Examine o slide usando os objetivos de 10x e 40x em microscópio de luz.
3. Resultados representativos:
Ver os arquivos anexados identificar os parasitas seguinte: (Nota: esses procedimentos irão detectar qualquer ovo, helmintos, ou apresentar cisto nas fezes ou no pêlo e da pele, apenas alguns destes estão listados abaixo)
Endoparasitas:
| Syphacia Muris (ovo, worm) | Chilomastix bettencourti |
| Syphacia obvelata (ovo, worm) | Hexamastix Muris |
| Aspiculuris tetraptera (ovo, worm) | Retortamonas sp. |
| Rodentolepis nana (ovo, worm) | Giardia spp. |
| Tritrichomonas Muris | Spironucleus Muris |
| Entamoeba Muris |
Ectoparasitas:
| Myocoptes musculinis | Radfordia affinis |
| Myocoptes musculinis | Radforida Ensifera |
| Myobia musculi |
| Teste de fita | De flutuação fecal | FCC | Exame direto 1 | PCR | |
| Protozoários | - | + | + + | + + + | + + + / NA 2 |
| Metazoários | |||||
| Pinworm | + / - 3 | + / - 4 | + 4 | + + + | + + + |
| Tênia 5 | - | + | + + | + + + | NA |
| Lombrigas outros 5 | - | + | + + + | + + + | NA |
1. Este método requer a eutanásia do animal.
2. Não há métodos de detecção PCR atualmente disponível para todos os protozoários.
3. Este método é mais adequado para detectar Syphacia spp.
4. Este método será mais fácil detectar Aspiculuris, e menos provável para detectar Syphacia.
5. Tapeworms e lombrigas que não pinworms são muito raros em ratos de laboratório moderno e ratos.
Classe tabela 1. Endoparasitos e de método de detecção adequado. Alguns métodos exigirá a eutanásia do animal. NA indica método não está actualmente disponível para estes parasitas + indica adequação do método para a detecção do parasita em questão, e -. Indica que o método não é recomendado para esse parasita.
| Solução | Peso específico | Ingredientes por 1L H 2 O |
| Cloreto de sódio | 1,20 | 311 g de cloreto de sódio |
| Nitrato de sódio | 1,20 | 338 g nitrato de sódio |
| Nitrato de sódio | 1,30 | 616 g nitrato de sódio |
| Açúcar | 1,20 | 1170 g de sacarose 1 |
| Açúcar é Sheather | 1,27-1,30 | 1563 g de sacarose 1 |
| Sulfato de zinco | 1,18 | 493 g de sulfato de zinco |
1. Estas soluções necessitam de refrigeração ou adição de 9 ml de fenol como conservante.
Tabela 2. Soluções de flutuação fecal (de Smith et al.)
| Fur colher (teste de fita) | Raspar a pele 1 | Exame direto 1 | PCR | |
| Piolhos | - | - | + + | NA |
| Ácaros | + | + | + + + | + + + / NA 3 |
| 4 pulgas | - | - | + | NA |
| Carrapatos 4 | - | - | + + | NA |
1. Este método requer anestesia se for para ser executada em um animal vivo.
2. Este método requer a eutanásia do animal.
3. Não há métodos de detecção PCR atualmente disponível para cada espécie de ácaro.
4. Pulgas e carrapatos são extremamente raros em instalações animais moderno laboratório.
Classe tabela 3. Da ectoparasita e método de detecção adequado. Alguns métodos exigirá a eutanásia do animal, e outros métodos que exigem anestesia para realizá-las em animais vivos. NA indica método não está actualmente disponível para estes parasitas. NA indica método não está actualmente disponível para estes parasitas + indica adequação do método para a detecção do parasita em questão, e -. Indica que o método não é recomendado para esse parasita.
Discussion
Quando se trabalha em um laboratório, a segurança deve ser sempre uma preocupação. Lembre-se de usar equipamento de protecção adequado quando se trabalha com animais e para limpar sua estação de trabalho com desinfectante antes e depois. Estes métodos são projetados principalmente para encontrar qualquer parasitas de roedores de laboratório nos locais analisados, ou seja, eles podem detectar parasitas exóticos ou extremamente rara, bem como o pinworms mais comuns e ácaros de pele. Embora eles são igualmente aplicáveis a outras espécies, roedores silvestres podem ter parasitas adicionais em locais como subcutâneo, fígado e cérebro, não avaliados pelos métodos acima.
Disclosures
Os autores são todos os funcionários da Charles River, um fornecedor de testes de diagnóstico e reagentes, incluindo os testes descritos acima.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cutting board | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Cat #36114 | |
| Small scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5910, G204 | 23mm blades, 3.5” length, straight |
| Medium scissors | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6808, G207 | 5” |
| Forceps-Curved | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8254 (M1/21004) | 4.5”, serrated, slight curve |
| Forceps-Microdissecting | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-5238 | Hudson-(EWALD) |
| Forceps-Tissue Forceps | Roboz Surgical Instruments Co. | RS-8160 | Rat tooth |
| Metal probe | VWR international | Cat#25778-000 | |
| Hemostats | Vantage | V97-48 | |
| Applicator sticks | Puritan | 6in Applicators, Ref#807 | |
| Dissecting microscope | Olympus Corporation | SZ51, Schott, ACE1 | |
| Petri dish | VWR international | 100mm, Cat#3401PDNL | |
| Cover slips | VWR international | Micro cover glass, Cat#48366-067 | |
| Slides | VWR international | VistaVision microscope slides Cat#16004-368 | |
| Inoculating loop | VWR international | Cat#50815-040 | |
| Light microscope | Olympus Corporation | Model#BX41TF | |
| Laboratory oven | Quincy Lab Inc. | Model 10 Lab Oven | |
| Centrifuge | Beckman Coulter Inc. | Allegra X-12R | |
| Vortexer | VWR international | Mini-Vortexer | |
| Test tube | Kimble Chase | 15 ml disposable centrifuge tube, Cat#73790-15 | |
| Cover slips | VWR international | Plastic microscope cover slips, 22mm, Cat#48376-049 | |
| White caps | VWR international | Cat#60869-089 | |
| Iodine | Rowley biochemical institute | Cat#SO-364 | |
| Zinc sulfate | Sigma-Aldrich | Cat#1000917519, Z4750-500G | |
| Sucrose | Mallinckrodt Baker Inc. | Cat#8360-06 | |
| Phenol | EMD Millipore | Cat#PX0510-1 | |
| Cellophane tape | Staples | Invisible tape, Cat#504712 | |
| Mineral oil | Mallinckrodt Baker Inc. | Cat#6358 |
References
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- Baker, D. G. Chapter 11. Flynn's Parasites of Laboratory Animals. Baker, D. G. , Blackwell. 303-398 (2007).
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