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Hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) son dos proteínas de superficie de los virus de influenza que se sabe que juegan un papel importante en el ciclo de vida viral y la inducción de respuestas inmunes protectoras 1,2. Como el principal objetivo de los anticuerpos neutralizantes, HA se utiliza actualmente como el marcador de potencia de la vacuna de la gripe y se mide por inmunodifusión radial simple (SRID) 3. Sin embargo, la dependencia del SRID de la disponibilidad de los antisueros correspondientes subtipos específicos de las causas de un mínimo de 2-3 meses de retraso para la liberación de todas las nuevas vacunas. Por otra parte, a pesar de la evidencia de que NA también induce inmunidad protectora 4, la cantidad de NA en vacunas de la gripe aún no está estandarizado debido a la falta de reactivos adecuados o métodos de análisis 5. Por lo tanto, simples métodos alternativos capaces de cuantificar los antígenos HA y NA son deseables para una liberación rápida y un mejor control de calidad de vacunas contra la influenza.
Regiones universalmente conservadas en todos los de la gripe A disposición de HA y NA secuencias fueron identificados por análisis de la bioinformática 6-7. Una secuencia (designado como Uni-1) fue identificado en el epítopo sólo universalmente conservadas de la HA, el péptido de fusión 6, mientras que dos secuencias conservadas fueron identificados en neuraminidasa, una cerca del sitio activo enzimático (designado como HCA-2) y el otra cerca de la N-terminal (designado como HCA-3) 7. Péptidos con estas secuencias de aminoácidos fueron sintetizados y utilizados para inmunizar a los conejos para la producción de anticuerpos. El anticuerpo contra el epítopo Uni-1 de HA fue capaz de obligar a 13 subtipos de influenza A-HA (H1-H13), mientras que los anticuerpos contra el HCA-2 y HCA-3 regiones de NA fueron capaces de unirse a los 9 subtipos de NA. Todos los anticuerpos mostraron especificidad notable contra las secuencias virales como lo demuestra la observación de que sin reactividad cruzada con las proteínas alantoideo fue detectado. Estos anticuerpos universales fueron utilizados para desarrollar los ensayos de slot blot para cuantificar la HA y NA de la gripe A vacunas sin la necesidad de antisueros específicos 7,8. Muestras de la vacuna se aplica en una membrana de PVDF utilizando un aparato de slot blot, junto con las normas de referencia diluido a diferentes concentraciones. Para la detección de HA, muestra y el patrón se diluye primero en Tris-buffer salino (TBS), que contiene urea 4M, mientras que para la medición de NA que se diluyeron en TBS que contiene 0,01% Zwittergent ya que estas condiciones mejora significativamente la sensibilidad de detección. Tras la detección de los antígenos HA y NA por inmunotransferencia con sus respectivos anticuerpos universales, la intensidad de señal se cuantificaron por densitometría. Las cantidades de HA y NA de las vacunas fueron calculados utilizando una curva estándar establecida con la intensidad de la señal de las distintas concentraciones de las referencias utilizadas.
Dado que estos anticuerpos se unen a epítopos universal en HA o NA, los investigadores interesados puedan utilizarlos como herramientas de investigación en los inmunoensayos que no sea el slot blot solamente.