Vibratome на разделы для работы с улучшенными Сохранение Cytoarchitecture из млекопитающих орган Корти

Summary

Простая процедура vibratome срезов органа Корти, а затем иммуногистохимии и конфокальной микроскопии описана. Эта процедура позволяет для улучшения сохранения тонкой cytoarchitecture млекопитающих орган Корти, и, следовательно, обеспечивает точную количественную оценку типов клеток.

Abstract

Млекопитающих кортиева органа высокоупорядоченных сотовой мозаику mechanosensory волосы и nonsensory поддерживающие клетки
(Обзор в ^1,2). Визуализация этой клеточной мозаики часто требует, чтобы орган Корти является кросс-секционного. В частности, nonsensory столп и клетки Дейтерса, ядра которых расположены при основании в отношении волосковых клеток, не могут быть визуализированы без перекрестного секционирования кортиева органа. Тем не менее, тонкое cytoarchitecture млекопитающих орган Корти, в том числе тонких цитоплазматических процессов столп и клетки Дейтерса, трудно сохранить обычными гистологическими процедуры, такие как парафин и крио-срезов, которые совместимы со стандартными методами иммуногистохимического окрашивания.

Здесь я опишу простой и надежной процедуру, состоящую из vibratome секционирования улитки, иммуногистохимического окрашивания vibratome секций в целом гору, а затем с помощью конфокальной микроскопии. Эта процедура широко используется для immunhistochemical анализ многих органов, включая почки мыши конечностей, данио кишечника, печени, поджелудочной железы и сердца (см. ^3-6 для отдельных примерах). Кроме того, эта процедура была успешен как для обработки изображений и quantitificaton столба номер ячейки в мутанта и контроля органов Корти в обоих эмбрионов и взрослых мышей ^7. Этот метод, однако, в настоящее время широко не используется, чтобы исследовать млекопитающих орган Корти. Потенциал для этой процедуры как обеспечить повышенную сохранность тонкой cytoarchitecture из взрослых орган Корти и позволяют количественно оценить различные типы клеток описано.

Protocol

1. Выделение и фиксация внутреннего уха

1. Для анализа клеточных паттернов в органе Корти, эвтаназии надлежащим поставил эмбрионов или взрослых.
2. Рассеките из слуховой капсулы, содержащие мембранных внутреннего уха. В мыши, это можно легко сделать на эмбрионах на эмбриональной (E) день 14,5 лет и старше, в котором E0.5 это день, при которой влагалищный плагин обнаружено не было. Препарирование слуховой капсулы осуществляется первым путем обезглавливания и открытие черепа в средней линии. Удалить мозга подвергать каждое ухо (рис. 1А). Внутренний слух может быть выложил нетронутыми использованием щипцов (таких, как Дюмон # 5, рис. 1В). Если изображение....

Discussion

Процедура vibratome секционирования, а затем иммуногистохимии и конфокальной микроскопии позволяет визуализацию органа Корти с минимальным повреждением тканей. Очевидно, конфокальной снимки, сделанные из внутренних районов в vibratome разделе показывают отличные сохранение клеточной морфологии, что ограничивается только фиксацией артефактов. Конфокальной снимки, сделанные рядом с двумя отключения поверхностей vibratome разделе часто неотличимых от изображения из внутренних районов, хотя случайные сотовой повреждений, на.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии (необязательно)
Leica VT1000S вибрационный Клинок Микротом	Leica
Zeiss LSM510 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии	Zeiss
Студенческая Дюмон # 5 Пинцет	Инструменты изобразительных наук	91150-20
Сверхчистых низкой температурой плавления агарозы	Invitrogen	16520-050
Пил-A-Way вложение плесень	Polysciences	18986 или 18646A
бычьего сывороточного альбумина	Джексон ImmunoResearch	001-000-162
Коза сыворотки	Invitrogen	16210-064
S100	Dako	Z0311
Alexa Fluor 568 козьего анти-IgG кролика	Invitrogen	-11036	1:1000 разбавления
Vectashield	Векторные Labs	H-1000
YO-PRO-1	Invitrogen	Y3603
вакуумной смазки	Рыболов	S41718
Affi-Gel Гель Синий	Bio-Rad	153-7301