Zahlreiche neuere Studien haben Mutationen in synaptischen Proteinen mit Hirnerkrankungen assoziiert identifiziert. Primär kultivierte kortikalen Neuronen bieten eine große Flexibilität bei der Prüfung der Auswirkungen dieser Krankheit assoziierte Proteine auf dendritischen Dorn Morphologie und Motilität.
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Methodenartikel
Die Analyse der dendritischen Spine Morphologie in Cultured ZNS-Neuronen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Dendritischen Dornen sind die Seiten der Mehrheit der exzitatorischen Verbindungen im Gehirn, und bilden die postsynaptischen Fach von Synapsen. Diese Strukturen sind reich an Aktin und haben gezeigt, dass eine hohe Dynamik. Aufgrund der klassischen Hebb'sche Plastizität sowie neuromodulatorischen Signale können dendritischen Dornen in Form und Zahl, die vermutlich von entscheidender Bedeutung sein für die Veredelung von neuronalen Schaltkreisen und die Verarbeitung und Speicherung von Informationen im Gehirn ist. Innerhalb dendritischen Dornen, Link ein komplexes Netzwerk von Proteinen extrazelluläre Signale mit dem Aktin cyctoskeleton ermöglicht die Kontrolle von dendritischen Dorn Morphologie und Anzahl. Neuropathologische Studien haben gezeigt, dass eine Reihe von Erkrankungen, angefangen von Schizophrenie, Autismus-Spektrum-Störungen, abnorme dendritischen Dorn Morphologie oder Zahlen anzuzeigen. Darüber hinaus haben die jüngsten genetischen Studien Mutationen in zahlreichen Genen, die synaptischen Proteine kodieren identifiziert, was für Vorschläge, dass diese Proteine an aberranten Wirbelsäule Plastizität, die zum Teil unterliegen der Pathophysiologie dieser Erkrankungen beitragen können. Um die mögliche Rolle dieser Proteine bei der Kontrolle der dendritischen Dorn Morphologien / Anzahl Studie bietet der Einsatz von kultivierten kortikalen Neuronen mehrere Vorteile. Erstens ermöglicht dieses System für hochauflösende Bildgebung der dendritischen Dornen in fixierten Zellen sowie Zeitraffer-Imaging lebender Zellen. Zweitens ermöglicht diese in vitro-System für einfache Handhabung der Funktion des Proteins durch Expression von mutierten Proteinen, Knockdown von shRNA-Konstrukte oder medikamentöse Behandlungen. Diese Techniken können die Forscher damit beginnen, die Rolle der krankheits-assoziierte Proteine zerlegen und vorherzusagen, wie Mutationen dieser Proteine können in vivo-Funktion.
Protokoll
Die hier beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um dendritischen Dorn Morphologie und Dynamik in jeder primären kultivierten Systems zu untersuchen.
1. Vorbereitung der primären kortikalen Neuronen Kulturen
- Bereiten Sie High-Density-kortikalen Neuronen Kulturen aus Sprague-Dawley Ratten E18 Embryonen und Kultur in Glia-bedingten serum-freiem Medium 1-2.
- Euthanize eine schwangere Ratte (E18) nach ACUC Verfahren; schnell zu entfernen Gebärmutter (mit Föten in it) und in eine 100 mm Petrischale auf Eis.
- Aufschneiden Gebärmutter und Amnionmembran, halten Fötus durch den Hals (Nabelschnur intakt....
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Diskussion
Die oben beschriebenen Techniken für die detaillierte quantitative Analyse der dendritischen Dorn Morphologie, lineare Dichte und Beweglichkeit in fester oder leben primären kortikalen Neuronen sind auf das Verständnis der Auswirkungen der postsynaptischen Mechanismen, die zu Neuropathologien beitragen können konzentriert. Ein ähnlicher Ansatz kann verwendet werden, um Wirbelsäule Morphologie und Motilität in allen stacheligen Neuron, einschließlich Hippocampus pyramidal, Purkinje, oder mittlere stachelige Neuronen zu q.......
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Offenlegungen
Die Produktion dieser Arbeit wurde durch MetaMorph (Molecular Devices, Inc.) unterstützt.
Danksagungen
Wir bedanken uns bei Kelly Jones für die sorgfältige Bearbeitung. American Heart Association Postdoctoral Fellowship (DPS);; Diese Arbeit wurde vom NIH R01MH 071316, Alzheimer Association, der National Alliance for Research on Schizophrenia and Depression (NARSAD) und die National Alliance for Autism Research (naar) (PP) unterstützt amerikanischen Heart Association Promotionsstipendium (KMW).
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Name des Reagenzes | Firma | Katalog-Nummer | Kommentare (optional) |
| 18 mm rund Deckglas Nr. 1.5 | Warner Instruments | 64-0714 (CS-18R15) | |
| 22 mm ² Deckglas Nr. 1.5 | Warner Instruments | 64-0721 (CS-22S15) | |
| Poly-D-Lysin | Sigma | P-0899 | MW 70 ~ 150 kDa |
| Neurobasal Medien | Invitrogen | 21103049 | |
| B27 | Invitrogen | 17504044 | |
| Glutamin | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140148 | |
| D, L-APV (AP-5) | Ascent Scientific | Asc-004 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| HEPES | MediaTech CellGro | 25 bis 060-C 1 | 1M, pH 7 |
| Formaldehyd-Lösung | EMD Chemicals | FX0415-5 | 36%, Histologie grade |
| Normale Ziegen Serum | VWR | 100188-514 | Jackson Immunoresearch Labs |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | AC21568-2500 | Acros Organics |
| Alexa Fluor 488 Ziege anti-Maus IgG (H + L) hochvernetzte adsorbiert | Invitrogen | A-11029 | |
| Alexa Fluor 488 Ziege anti-Kaninchen IgG (H + L) * hochvernetzte adsorbiert * | Invitrogen | A-11034 | |
| ProLong Gold-Antifade Reagenz | Invitrogen | P36934 | Spezielle Verpackungen |
| Anbei Abbildungsstufe Kammer | Warner | RC-30HV | |
| Temperature Controller-Einheit | Warner | TC-344B | |
| MetaMorph | Universal Imaging |
Referenzen
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336, 185-186 (1988).
- Xie, Z. Kalirin-7 controls activity-dependent structural and functional plasticity of dendritic spines. Neuron. 56, 640-656 (2007).
- Spear, L.
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Nachdrucke und Genehmigungen
