$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
الهدف الأساسي لكل من علم الأعصاب الأساسي والسريري هو فهم الهويات والتركيب الجزيئي وأنماط الاتصال المميزة للخلايا العصبية في كل من الدماغ الطبيعي والمريض. لتحقيق هذا ، تم بذل قدر كبير من الجهد لبناء خرائط تشريحية عصبية عالية الدقة1-3. مع توسع علم الوراثة الجزيئي والتقدم في الفحص المجهري الضوئي ، جاءت القدرة على الاستعلام ليس فقط عن الأشكال العصبية ، ولكن أيضا التركيب الجزيئي والخلوي للخلايا العصبية الفردية والشبكات المرتبطةبها 4. تسمح التطورات الكبيرة في القدرة على تمييز الخلايا العصبية ومعالجتها من خلال تقنيات استهداف الجينات المعدلة وراثيا في القوارض الآن للمحققين "برمجة" مجموعات فرعية عصبية حسبالرغبة 5-6. يمكن القول إن واحدة من أكثر المساهمات تأثيرا في علم الأعصاب المعاصر كانت اكتشاف واستنساخ الجينات التي تشفر بروتينات الفلورسنت (FPs) في اللافقاريات البحرية7-8 ، جنبا إلى جنب مع هندستها اللاحقة لإنتاج صندوق أدوات دائم التوسع من المراسلينالحيويين 9. إن استغلال نشاط المحفز الخاص بنوع الخلية لدفع تعبير FP المستهدف في مجموعات الخلايا العصبية المنفصلة يتيح الآن تحقيقا تشريحيا عصبيا بدقة جينية.
< p class = "jove_content" > هندسة التعبير FP في الخلايا العصبية قد حسنت بشكل كبير فهمنا لبنية الدماغ ووظيفته. ومع ذلك ، فإن تصوير الخلايا العصبية الفردية والشبكات المرتبطة بها في أنسجة المخ العميقة ، أو في ثلاثة أبعاد ، ظل يمثل تحديا. بسبب ارتفاع نسبة الدهون ، تكون الأنسجة العصبية معتمة إلى حد ما وتظهر التألق التلقائي. تجعل هذه الخصائص الفيزيائية الحيوية المتأصلة من الصعب تصور وتصوير الخلايا العصبية المصنفة فلورية بدقة عالية باستخدام الفحص المجهري القياسي أو متحد البؤر خارج أعماق عشرات الميكرونات. للتحايل على هذا التحدي ، غالبا ما يستخدم الباحثون طرق التصوير وإعادة البناء ذات المقطع الرقيقالتسلسلي 10 ، أو الفحص المجهري بالليزر 2 فوتون11. العيوب الحالية لهذه الأساليب هي إعداد الأنسجة كثيف العمالة المرتبط بها ، أو الأجهزة الباهظة التكلفة على التوالي.
هنا ، نقدم طريقة سريعة وبسيطة نسبيا لتصور الخلايا المصنفة بالفلورسنت في شرائح دماغ الفأر شبه السميكة الثابتة عن طريق المقاصة البصرية والتصوير. في البروتوكول المرفق ، نصف طرق: 1) تثبيت أنسجة المخ في الموقع عن طريق التروية داخل القلب ، 2) تشريح وإزالة الدماغ بالكامل ، 3) تضمين الدماغ الثابت في الاغاروز ، 4) تحضير دقيق للشرائح شبه السميكة باستخدام أجهزة الاهتزاز الجديدة ، 5) تنظيف أنسجة المخ من خلال تدرج الجلسرين ، و 6) التركيب على شرائح زجاجية للفحص المجهري الضوئي وإعادة بناء المكدس z (الشكل 1).
لإعداد شرائح الدماغ ، قمنا بتنفيذ قطعة جديدة نسبيا من الأجهزة تسمى "Compresstome" VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). هذه الأداة عبارة عن ميكروتوم شبه آلي مجهز بنظام متقدم وشفرة بمحركات مع ميزات مشابهة في الوظيفة للاهتزازات الأخرى. على عكس الاهتزازات الأخرى ، يتم تثبيت الأنسجة المراد تقطيعها في سدادة الاغاروز داخل أسطوانة من الفولاذ المقاوم للصدأ. يتم بثق الأنسجة بالسماكة المرغوبة من الأسطوانة ، ويتم قطعها بواسطة الشفرة الاهتزازية المتقدمة إلى الأمام. يسمح نظام قابس / أسطوانة الاغاروز بتركيب الأنسجة القابلة للتكرار والمحاذاة والقطع الدقيق. في أيدينا ، ينتج عن "Compresstome" شرائح أنسجة عالية الجودة للفيزيولوجيا الكهربية ، والكيمياء المناعية ، وتركيب الأنسجة الثابتة المباشرة والتصوير. إلى جانب المقاصة البصرية ، نوضح هنا تحضير شرائح الدماغ الثابتة شبه السميكة للتصوير الفلوري عالي الدقة.