Präparation des Adult Zebrafisch Kidney

Summary

Der Zebrafisch Niere ist die Heimat sowohl Nieren-und blutbildenden adulten Stammzellen / Vorläuferzellen, und stellt eine hervorragende Gelegenheit, diese Zelltypen und ihre Nachkommen in einem Wirbeltier Modell-Organismus zu studieren. Hier zeigen wir eine detaillierte Analyse Verfahren, dass der Forscher ermöglicht zu erkennen und operativ zu entfernen, die erwachsenen Zebrafisch Niere, die für Anwendungen wie Zellisolation, Transplantationsmedizin und Expressionsstudien von Nieren-und / oder Blut Zellpopulationen verwendet werden können.

Abstract

Die Forscher arbeiten in dem aufstrebenden Gebiet der adulten Stammzellen Biologie versuchen, die Signale, die das Verhalten und die Funktion von Stammzellen während der normalen Homöostase und Krankheit Staaten regeln zu verstehen. Das Verständnis von adulten Stammzellen hat breite reichende Folgen für die Zukunft der Regenerativen Medizin ^1. Zum Beispiel kann ein besseres Wissen über adulte Stammzellen Zellbiologie erleichtern die Gestaltung der therapeutischen Strategien in welchen Organen ausgelöst werden, um sich selbst oder auch die Schaffung von Verfahren für den Anbau von Organen in vitro, die in Menschen ¹ transplantiert werden können heilen. Der Zebrafisch hat sich zu einem leistungsstarken Tiermodell für die Untersuchung von Wirbeltieren Zellbiologie ^2. Es hat eine umfangreiche Dokumentation und Analyse der embryonalen Entwicklung im Zebrafisch ³ wurde. Erst vor kurzem haben Wissenschaftler versucht, erwachsene Anatomie und chirurgische Dissektion Techniken ^4-Dokument, da es eine progressive Bewegung innerhalb der Zebrafisch-Community, um die Anwendungen dieser Forschung Organismus Studien mit Erwachsenen zu erweitern wurde. Zum Beispiel gibt es den Ausbau Interessen bei der Nutzung Zebrafische, um die Biologie von adulten Stammzell-Populationen zu untersuchen und anspruchsvollen Erwachsenen-Modelle von Krankheiten wie Krebs ^5. Historisch gesehen hat die Isolierung des Zebrafisch erwachsenen Nieren wurden für die Untersuchung Hämatopoese instrumental, als die Niere der anatomischen Lage der Blutkörperchen in Fischen ^6,7 ist. Die Niere ist von Nephron Funktionseinheiten in arborized Regelungen gefunden, um hämatopoetische Gewebe, das in den Zwischenräumen verteilt ist umgeben sind. Die hämatopoetischen Komponente besteht aus hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) und ihre Nachkommen, dass die Niere leben, bis sie unheilbar unterscheiden ^8. Darüber hinaus ist es nun klar, dass eine Gruppe von renaler Stamm / Vorläuferzellen (RPCs) bewohnen auch der Zebrafisch Nieren Orgel und ermöglichen sowohl Nieren-Erneuerung und Wachstum, wie in anderen Fischarten ^9-11 beobachtet. Im Lichte dieser neuen Entdeckung ist die Zebrafisch-Niere ein Organ, dass der Standort von zwei spannende Möglichkeiten für adulte Stammzellen Zellbiologie Studien Häuser. Es ist klar, dass viele offene Fragen und konnte mit diesem experimentellen System bedient werden. Zur Förderung Expansion auf diesem Gebiet, ist es von Vorteil, um detaillierte Methoden der Sichtbarmachung Dokument und dann die Isolierung des erwachsenen Zebrafisch Niere Organ. Dieses Protokoll Einzelheiten unseres Verfahrens zur Dissektion der erwachsenen Nieren von beiden fixierten und fest Tieren. Dissection der Niere Organ kann zur Isolierung und Charakterisierung von hämatopoetischen und renalen Stammzellen und ihren Nachkommen mit etablierten Techniken wie Histologie, Fluoreszenz-activated cell sorting (FACS) ^11,12, expression profiling ^13,14 und ^11,15 Transplantation werden. Wir hoffen, dass die Verbreitung dieses Protokolls werden die Forscher mit dem Wissen, dass die breitere Verwendung von Zebrafisch-Studien, die letztlich für die Anwendung beim Menschen übersetzt werden kann umzusetzen.

Protocol

1. Dissection der erwachsenen Zebrafisch Niere von einer nicht fixierten Tier Probe

1. Wählen Sie einen erwachsenen Zebrafisch zwischen 3-6 Monaten im Alter für die Präparation.
2. Euthanize die Fische, indem Sie sie in eine Schale mit 0,2% Tricaine pH 7,0 für ca. 4-5 Minuten und beobachtete sorgfältig, um zu sehen, dass die Kiemen bewegen und das Herz aufhört zu schlagen aufhören.
3. Mit einem Löffel, heben Sie den Fisch aus dem Tricaine Bad in eine kleine Menge der Lösung, giesst die Lösung und sanft Ort das Tier auf einem Papiertuch.
4. Mit einem scharfen Paar Dissektion Schere in den Kopf des Tieres zu entfernen, so dass ein Schnitt direkt hinter den Kiemen Operculum (Abb. 1, Weg A). Entsorgen Sie den Kopf in einer biohazard Abfallbehälter.
5. Verwenden Sie das Sezieren einer Schere, um den Körper des Tieres geöffnet, durch einen langen ventralen Inzision, beginnend mit dem Kopf und endet bei der Schwanz an der Basis der Schwanzflosse (Abb. 1, Weg B).
6. Entfernen Sie die inneren Organe des Tieres mit einem Paar Dissektion Pinzetten / Pinzette und lege sie in biohazard Abfall. Achten Sie darauf, die dorsale Körperwand Pinsel, da dies die Lage der Niere (Abbildung 2). Wenn Sie ein weiblicher Fisch ausgewählt haben, müssen Sie sich entwickelnden Eier Schaufel aus der Körperhöhle, die am leichtesten getan werden kann, mit einer abgewinkelten Pinzette oder einer Pinzette.
7. Verwenden Sie Dissektion Nadeln pin offenen Körper Wände zu einer Dissektion Tablett, und der Winkel der Pins so, dass die Niere visualisiert werden können. Die Niere wird besitzen eine charakteristische Form (Kopf, Rumpf / Sattel, Schwanz) und Farbe, die mit schwarz gefärbte Pigmentierung (Abbildung 2) durchsetzt. Möglicherweise finden Sie auch die Aorta mit dem peripheren Blut, die nach unten läuft der Mittellinie des Organs Struktur gefüllt.
8. Verwenden feinen Pinzette auf die Niere aus dem dorsalen Körperwand zu lösen, mit einer Pinzette auf die Niere heben Sie die Orgel aus dem Bindegewebe, die ihm zugrunde liegenden trennen.
9. Sanft legen Sie die Niere in das gewünschte Fahrzeug für weitere Studien an lebenden Zellen, wie ein Mikrozentrifugenröhrchen mit 1x PBS für FACS Vorbereitung.

2. Vorbereitung und Präparation der erwachsenen Zebrafisch Niere von einer festen Tier Probe

1. Bereiten Sie eine Lösung aus 4% paraformaldehyde/1X PBST. Kochen Sie die Lösung für die PFA in Lösung auflösen, dann die Mischung wird auf 4 ° C und 0,1% Dimethylsulfoxid. Wir haben den größten Erfolg mit Gewebe Bewahrung vor mit frisch zubereiteten PFA-Lösungen wie zum gefrorenen Aliquots entgegen. Machen Sie genügend Lösung tauchen erwachsenen Zebrafisch beim Präparieren.
2. Füllen Sie eine Dissektion Tablett mit genug Fixierung Lösung tauchen erwachsenen Zebrafisch während der Präparation. Wir führen die weiteren Schritte mit diesem Fach unter dem Mikroskop positioniert, die in einer chemischen Motorhaube platziert werden können, um die Exposition der Fixierung Gerüche vermieden werden.
3. Wählen Sie einen erwachsenen Zebrafisch zwischen 3-6 Monaten im Alter für die Präparation.
4. Euthanize die Fische, indem Sie sie in eine Schale mit 0,2% Tricaine pH 7,0 für ca. 5 Minuten und beobachtete sorgfältig, um zu sehen, dass die Kiemen und Herz aufhören zu schlagen.
5. Mit einem Löffel, heben Sie den Fisch aus dem Tricaine Bad in eine kleine Menge der Lösung, giesst die Lösung und sanft Ort das Tier auf einem Papiertuch.
6. Mit einem scharfen Paar Dissektion Schere in den Kopf des Tieres zu entfernen, so dass ein Schnitt direkt hinter den Kiemen Operculum (Abb. 1, Weg A). Entsorgen Sie den Kopf in einer biohazard Abfallbehälter, und sofort Platz das Tier in die PFA-haltigen Präparation Fach.
7. Verwenden Sie das Sezieren einer Schere, um den Körper des Tieres geöffnet, durch einen langen ventralen Inzision, beginnend mit dem Kopf und endet bei der Schwanz an der Basis der Schwanzflosse (Abb. 1, Weg B), und halten den Körper teilweise während der Überflutung das Verfahren.
8. Entfernen Sie die inneren Organe des Tieres mit einem Paar Dissektion Pinzetten / Pinzette und lege sie in biohazard Abfall. Achten Sie darauf, die dorsale Körperwand Pinsel, da dies die Lage der Niere (Abbildung 2).
9. Verwenden Sie Dissektion Nadeln pin offenen Körper Wände und Winkel die Stifte, so dass die Niere visualisiert werden können. Die Niere wird besitzen eine charakteristische Form (Kopf-, Sattel, Schwanz) und Farbe, die mit schwarz gefärbte Pigmentierung (Abbildung 2) durchsetzt. Möglicherweise finden Sie auch die Aorta mit dem peripheren Blut, die nach unten läuft der Mittellinie des Organs Struktur gefüllt.
10. Fix die Probe über Nacht, indem das Fach bei 4 ° C, wenn Sie bei der Organisation der gewünschten Proben fertig sind.
11. Am nächsten Tag, entfernen Sie die PFA-Lösung aus der Schublade und ersetzen mit 1x PBST.
12. Verwenden feinen Pinzette vorsichtig lösen die Niere aus dem dorsalen Körperwand, mit einer Pinzette auf die Niere heben Sie die Orgel aus dem Bindegewebe, die ihm zugrunde liegenden trennen. Das Nierengewebe wird weich und geschmeidig aus der DMSO in die Fixierlösung, die es ermöglichen, die gesamte Niere Orgel in einem Stück zu sezieren.
13. Verwenden Sie eine breiteBohrung Transfer-Pipette auf die Niere in ein Mikrozentrifugenröhrchen Platz.
14. Die Niere kann nun weiter bearbeitet werden, um histologische oder whole mount in situ Genexpression Studien über die gewünschte Studie basiert befragen.

3. Repräsentative Ergebnisse:

Die Schritte, die in Abbildung 1 schematisch dargestellt sind, zeigen die Zerlegung Verfahren. Die Niere kann anhand ihrer charakteristischen Form und Färbung, und anatomische Lage an der dorsalen Wand des Tieres Körperhöhle identifiziert werden, wie in Abbildung 2 dargestellt. Nach der Präparation einer festen Nieren Probe whole mount in situ Hybridisierung kann zur Lokalisierung der Expression eines Gens von Interesse sein, wie in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 1: Verfahren, die einen direkten Zugang zum Präparieren der Zebrafisch erwachsenen Nieren ermöglicht. (A) eingeschläfert Zebrafisch ist in schrittweise zerlegt (durch Zahlen und Pfeile), um den Forscher am einfachsten Zugriff auf die komplette Niere Organ. Bilder von der Bauchhöhle vor (B) und nach (C) Entfernung der Bauchorgane.

Abbildung 2:. Visualisierung der Zebrafisch-Niere in einer nicht fixierten Probe Nach Entnahme von Organen in der Leibeshöhle, erscheint die Niere als eine einzelne, abgeflachte Organ, das Anhänger der dorsalen Körperwand über Bindegewebe (A) ist, und wurde schematisiert (B) an ihre anatomische Form zu zeigen.

Abbildung 3: Whole mount in situ Hybridisierung auf dem gesamten erwachsenen Nieren-Orgel durchgeführt. (A) cadherin17 Transkripte sind in den Tubulus der erwachsenen Nieren Nephrone erkannt, vergrößert in (A '). (B) mafba Transkripte proximalen Nephron Zelltypen in der adulten Niere (zu vergleichen, um ganze Tubulus in Panel A) lokalisiert sind. (B' ) Eine vergrößerte Ansicht mafba Ausdruck zeigt, dass Transkripte sind speziell auf die Podozyten (P) Zellen des Blutes Filter (Glomerulus) und proximalen Tubulus (PCT) lokalisiert.

Discussion

Adulte Stammzellen sind dynamisch und wesentliche Komponenten, die den erwachsenen Körper Form ¹ aufrecht zu erhalten. Adulte Stammzellen können auch dazu dienen, Schäden entgegenwirken, die den Körper entstehen während der Erkrankungen und der Dysfunktion oder Verlust von adulten Stammzellen, um den Rückgang der Organfunktion führen und hat in Verbindung gebracht, um Krebs Malignome fahren und tragen zur Alterung. Adulte Stammzellen weisen zelluläre Eigenschaften, die sie von differenzierten Zelltypen unterscheiden. Bei der Zellteilung werden adulte Stammzellen in der Lage sich selbst zu erneuern und die Produktion von Vorläuferzellen, die wiederum Anlass zu verschiedenen differenzierten Nachkommen geben können. Es besteht ein großes Interesse für das Verständnis der Signalwege, die die Zelle Schicksal Entscheidungen und Wirksamkeit von adulten Stammzellen aufgrund ihrer wichtigen Rolle in Gewebshomöostase ¹ zu regeln. Zum Beispiel sind viele Wissenschaftler, die derzeit versuchen, die Signale, die verschiedene erwachsenen Stammzell-Populationen in ihrer Nische, oder spezielle Mikroumgebung, und wie diese Nische wird durch humorale Faktoren beeinflusst halten zu identifizieren.

Adult hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) sind pluripotente Zellen, die Kraftstoff die kontinuierliche Verjüngung der Blutkörperchen bei Tieren ^8. Hämatopoese ist eine lebendige Prozess, der ständig laufende während der Lebensdauer eines Wirbeltier-Organismus, weil die reifen differenzierten Blut Zelltypen kurzlebig sind und müssen daher regelmäßig erneuert werden. Als sie sich teilen, Versorgung HSCs dieser entscheidenden Nachfrage durch Selbst-Erneuerung und Herstellung einer Reihe von Vorläufern, die Anlass zu der erythroiden, Megakaryozyten, lymphoiden und myeloischen Linien. Jede dieser Blut Zelltypen führt einzigartige Funktionen in den Kreislauf, einschließlich der Bereitstellung der Gasaustausch im Gewebe, so zum Abdichten von Verletzungen der Blutgefäße durch die Bildung von Blutgerinnseln oder Abwehrmechanismen gegen eindringende Krankheitserreger. Während HSCs seit vielen Jahren erkannt haben, bleiben eine Fülle von faszinierenden Fragen offen über diese faszinierenden Zellen. Jüngste Studien haben Unterklassen von HSK mit verschiedenen langfristigen Selbst-Erneuerung Eigenschaften und die Aufklärung der Nische Komponenten und signalisiert, dass HSC Verhalten modulieren ⁸ identifiziert. Der Zebrafisch gehört heute zu den Eckpfeilern der Hämatopoese Forschung Paradigmen, basierend auf der genetischen und molekularen Eigenschaften von diesem Tiermodell ^8. Forschung unter Verwendung der Zebrafisch hat zu neuen Einsichten über HSC Biologie, die mit höheren Wirbeltiere wie Säuger konserviert sind, betonen die biomedizinischer Relevanz von Fisch Blutuntersuchungen ⁸ geführt.

Historisch gesehen hat das Wissen über HSCs ebnete den Weg für die Expeditionen versucht, herauszufinden, ob andere Körperorgane durch adulte Stammzellen beibehalten werden. Zahlreiche erwachsenen Stammzell-Populationen sind jetzt geschätzt auf zu existieren, reicht über verschiedene Strukturen aus dem Gehirn in den Darm, Haut und Skelettmuskulatur. Fortsetzung der Bemühungen in der Stammzell-Bereich suchen, um herauszufinden, wie adulte Stammzellen oder sogar andere differenzierte Zelltypen können verbesserte Wirksamkeit in verschiedenen Einstellungen anzuzeigen.

Im Hinblick auf die Niere, hat es große Debatten unter Nephrologen, ob Nieren-Stammzellen ¹⁶ vorliegen worden. Unabhängige Erkenntnisse haben Populationen von Nierenzellen in Säugetieren, die in unterschiedlichem Maße von regenerativen Potential besitzen dokumentiert, aber ein zusammenhängendes Verständnis dieser Berichte ist noch nicht erreicht werden. Interessanterweise gibt es starke Hinweise auf die Vorstellung, dass viele Fischarten Zellen, die robust Kraftstoff Regeneration geschädigter Nephrone können sowie wachsen völlig neue Nephrone im Erwachsenenalter ⁹ besitzen unterstützen. Neuere Arbeiten haben die molekulare Kennzeichen der erwachsenen Nieren-Stammzellen in der Zebrafisch ^10,11 identifiziert, und demonstrierte die Selbst-Erneuerung Potenz dieser sogenannten renalen Stammzellen / Vorläuferzellen (RPCs) ^11. Zukünftige Studien sind notwendig, um festzustellen, ob analog Nierenzellen in Säugern sind. Dennoch kann weiterhin Untersuchungen über die zellulären und molekularen Mechanismen, die Fische RPCs regulieren Einblick in die regenerative Leistungen können in der Säugetierniere stimuliert werden können. Es ist offensichtlich, dass noch viel über RPCs verstanden werden, und dass die vielen Tools nun auch für die Zebrafisch-Forscher kann implementiert, um diese faszinierenden Fragen anzugehen.

In diesem Protokoll, beschreiben wir unsere Methode zur anatomischen Identifizierung und Präparation des erwachsenen Zebrafisch Niere. Alternative Schritte können verwendet werden, um die Nieren, wie das Öffnen der Bauchhöhle mit einer ventralen Schnitt mit einer Schere zerschneiden Dissektion werden, aber wir haben den größten Erfolg beim Zugriff auf die gesamte Niere, wenn die Bauchdecke wird merken offen und der Kopf wird entfernt angetroffen. Blut und Nieren Wissenschaftler gleichermaßen, zu isolieren und mit diesen Zelltypen arbeiten möchten, können Sie entweder Dissektion Methode. Es sollte angemerkt werden, dass die Methode, die wir beschreiben, für die Isolierung und working mit dem Zebrafisch erwachsenen Nieren ist sicherlich nicht an Wissenschaftler, die zu Fragen der Erwachsenenbildung Stammzellbiologie zu verfolgen, als das Sezieren von diesem Organ können die Untersuchungen über die Forscher weitere Untersuchungen zu Themen wie Physiologie der Alterung zu erleichtern möchten begrenzt. Darüber hinaus kann diese Methode mit anderen Technologien wie Transgenik gekoppelt werden, um so molekular-Label und dann zu reinigen und zu studieren diskreten Subpopulationen von Blut oder Nierenzellen aus Wildtyp-und genetisch mutierte Zebrafische ^11. Wir freuen uns, derart detaillierte Reinigungsverfahren von Stamm-und Vorläuferzellen Zelltypen ist von entscheidender Bedeutung, um zu gewinnen Wissen darüber, wie ihr Verhalten reguliert wird, als operative Tests wie Transplantation oder Vorläuferzellen Kultivierung der Grundlage bilden, durch die die Wirksamkeit und die Identität dieser Zellen ist definiert. Jüngste Fortschritte in der hämatopoetischen Vorläuferzellen Kultur Methoden öffnen viele neue Wege für die Studie und kann zu Kultivierung der Nierenfunktion Bevölkerung ¹⁷ angepasst werden. Zebrafisch chemische Genetik wurden bei der Ermittlung von Wegen, die HSZ-und Nierenfunktion Vorfahren in verschiedenen Kontexten ^18-20 modulieren, und wird auch weiterhin eine sinnvolle Möglichkeit, die im Kombination mit den oben zellbiologischen Techniken Test erfolgreich zu sein. Zusammengenommen gibt es eine Reihe von bahnbrechenden Beiträge auf den Gebieten der Hämatologie und Nephrologie mit dem Zebrafisch-Modell gewesen, und die weitere Forschung in diesen Arenen Versprechungen zu führen weitere transformative Einblicke in den kommenden Jahren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissection scissors	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5882
Dissection forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5010
Dissection angled forceps	Roboz Surgical Instruments Co.	RS-5058
Tricaine	Sigma-Aldrich	E10521
Paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	19210