نحن نقدم بروتوكول محسنة لاستخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. يتم فصل الخلايا الميكروبية من مصفوفة حصيرة قبل استخراج الحمض النووي وتنقيتها. هذا من شأنه أن يعزز تركيز ، والجودة ، وحجم الحمض النووي. ويمكن استخدام بروتوكول الحرارية للعينات أخرى.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
استخراج الحمض النووي عالية الوزن الجزيئي من ماتس الميكروبية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تحليل ناجحة ودقيقة ، وتفسير البيانات metagenomic يعتمد على استخراج كفاءة عالية الجودة ، وارتفاع الوزن الجزيئي المجتمع الحمض النووي (HMW). ومع ذلك ، والعينات البيئية تشكل حصيرة غالبا ما يواجهون صعوبات في الحصول على تجمعات كبيرة عالية الجودة HMW الحمض النووي. الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة تحتوي على كميات عالية من المواد البوليمرية خارج الخلية (EPS) (1) والأملاح التي قد تمنع التطبيقات المصب من الحمض النووي المستخرج. وغالبا ما تستخدم أساليب مباشرة وقاسية في استخراج الحمض النووي من عينات الحرارية. وعادة ما تستخدم هذه الأساليب لأن العائد على السهم في الفرش ، ومصفوفة لاصقة ، تربط الحمض النووي 2،3 أثناء تحلل المباشر. نتيجة لأساليب أشد قسوة الاستخراج ، والحمض النووي أصبحت مجزأة إلى أحجام صغيرة 4،5،6.
الحمض النووي وهكذا يصبح مناسبة لاستنساخ ناقلات كبيرة إدراج. من أجل الالتفاف على هذه القيود ، ونحن التقرير منهجية محسنة لاستخراج الحمض النووي HMW من نوعية جيدة وكمية من الحصير الجرثومية الشديدة الملوحة. استخدمنا أسلوب غير المباشرة التي تنطوي على فصل الخلايا الميكروبية من الخلفية مصفوفة حصيرة من خلال المزج والطرد المركزي المغاير. وكان استخدام مجموعة من الإجراءات الميكانيكية والكيميائية لاستخلاص وتنقية من الحمض النووي للخلايا الجرثومية المستخرجة. بروتوكول لدينا ما يقرب من 2 ميكروغرام الغلة من الحمض النووي HMW (35-50 كيلوبايت) في كل غرام من العينة حصيرة ، مع نسبة 260 / 280 ألف من 1.6. وعلاوة على ذلك ، والتضخيم من جينات الرنا الريباسي 16S 7 تشير إلى أن البروتوكول هو قادر على تقليل أو القضاء على أي آثار المثبطة من الملوثات. نتائجنا توفر منهجية ملائمة لاستخراج الحمض النووي من الحصير HMW الميكروبية للدراسات الفنية وmetagenomic يمكن أن تنطبق على غيرها من العينات البيئية التي استخراج الحمض النووي هو التحدي.
البروتوكول
1. خلية الميكروبية الاستخراج :
- التجانس الحصير الميكروبية مع مدقة العقيمة طحن عن طريق خلط دقيق. مكان تقريبا كل 30 غراما (وزن رطب) من المادة حصيرة المتجانس في حاوية معقمة من خلاط وارنج ، إضافة حوالي 100 مل من كلوريد الصوديوم M 1 (أو تركيز محدد على العينة في الاستخدام) ، ومزيج ثلاث مرات على سرعة متوسطة لمدة 1 دقيقة مع متقطعة التبريد في الثلاجة -20 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. نقل الطين في زجاجة 250 مل الطرد المركزي وملء ما تبقى فارغة مع حجم كلوريد الصوديوم M 1. يعد حل كلوريد الصوديوم في المياه وتعقيمها DI تصفية تعقيم عليه.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نظرا إلى أن مجموع إزالة الخلية من المعقدة والمتنوعة للغاية العينات الجرثومية حصيرة ليس عمليا ، فإن القلق الأساسي هو مدى الخلايا المستخرجة تمثل حصيرة الميكروبية الشاملة المجتمع. في دراسة سابقة ، أظهرت PCR - DGGE تحليل الجينات الميكروبية 16S الرنا الريباسي أن إزالة الخلايا خمس خطوات المستخدمة في هذا البروتوكول مقتطفات الخلايا التي تمثل المجتمع الميكروبية حصيرة الشاملة 7. الخطوات المطلوبة من العدد الفعلي لاستخراج الخلايا لتوفير بيليه الخلية التي هي ممثلة للمجتمع الكلي المي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال برنامج المؤسسة الوطنية للعلوم البيئية جينوم (رقم المنحة EF - 0723707).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | تعليقات |
| β - المركابتويثانول | سيغما الدريخ | M3148 | |
| البولي ايثيلين جلايكول 8000 | Promega | V3011 | 20 ٪ من كلوريد الصوديوم 1.2 M |
| أسيتات البوتاسيوم | فيشر العلمية | فيشر العلمية | |
| كوانت - IT طقم الفحص dsDNA | Invitrogen | Q33130 | |
| ريبونوكلياز | Epicentre | MRNA092 | |
| كلوريد الصوديوم | BDH كيماويات | BDH8014 | اضرب المناسبة. |
| سلفات الصوديوم دوديسيل | فيشر العلمية | 03-500-509 | 10 ٪ في الماء |
| فوسفات الصوديوم | EMD كيماويات | SX0583 - 3 | 2 ٪ في الماء |
| TBE | فيشر العلمية | BP1333 - 1 | |
| CHEF مخطط نظام XA | راد مختبرات بيولوجية | 170-3670 | |
| معمل NanoDrop 1000 | الحرارية العلمية | ND - 1000 | |
| Vortexer | العلمي للصناعات المحدودة | ||
| الأشعة فوق البنفسجية Crosslinker | UVP | ||
| وارنج خلاط | وارنج المختبر | LB10S |
المراجع
- Decho, A. W. Microbial biofilms in intertidal systems: an overview. Cont. Shelf Res. 20, 1257-1273 (2000).
- Dupraz, C., Visscher, P. T. Microbial lithification in marine stromatolites and hypersaline mats. Trends Microbiol. 13, 429-438 (2005).
- Steff....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
