Extractie met een hoog molecuulgewicht DNA van microbiële matten

Summary

Wij bieden een verbeterde protocol voor de extractie van een hoog moleculair gewicht DNA van hypersaline microbiële matten. Microbiële cellen worden gescheiden van de mat matrix voorafgaand aan de DNA-extractie en zuivering. Dit verhoogt de concentratie, de kwaliteit en de grootte van het DNA. Het protocol kan worden gebruikt voor andere vuurvaste monsters.

Abstract

Succesvolle en nauwkeurige analyse en interpretatie van metagenomic gegevens is afhankelijk van de efficiënte afzuiging van hoge kwaliteit, hoge moleculair gewicht (HMW) gemeenschap DNA. Echter, het milieu mat monsters nogal eens voor problemen op het verkrijgen van grote concentraties van hoge kwaliteit, HMW DNA. Hypersaline microbiële matten bevatten grote hoeveelheden extracellulaire polymere stoffen (EPS), een en zouten die kan remmen afgeleide toepassingen van de geëxtraheerde DNA. Direct en harde methoden worden vaak gebruikt in de DNA-extractie van vuurvaste monsters. Deze methoden worden vaak gebruikt omdat de winst per aandeel in matten, een klevende matrix, bindt DNA ^2,3 in de directe lysis. Als gevolg van de hardere extractiemethoden, DNA gefragmenteerd raakt in kleine maten ^4,5,6.

Het DNA wordt dus niet geschikt voor grote-insert vector klonen. Om deze beperkingen te omzeilen, hebben we een verslag van een verbeterde methodologie voor HMW DNA van goede kwaliteit en kwantiteit van hypersaline microbiële matten extract. We gebruikten een indirecte methode waarbij de scheiding van microbiële cellen van de achtergrond mat matrix door middel van het mengen en het differentieel centrifugeren. Een combinatie van mechanische en chemische procedures werd gebruikt om DNA extraheren en te zuiveren van de uitgepakte microbiële cellen. Ons protocol levert ongeveer 2 ug van HMW DNA (35-50 kb) per gram monster mat, met een A _260/280 ratio van 1,6. Bovendien is versterking van de 16S rRNA genen ⁷ suggereert dat het protocol in staat is te minimaliseren of te elimineren remmende effecten van verontreinigingen. Onze resultaten geven een geschikte methode voor de extractie van HMW DNA van microbiële matten voor functionele metagenomic studies en van toepassing kunnen zijn op andere milieu-monsters waaruit DNA-extractie is een uitdaging.

Protocol

1. Microbiële cel Extractie:

1. Homogeniseren microbiële matten met een steriele malen stamper door het mengen grondig. Plaats ongeveer alle 30 g (nat gewicht) van gehomogeniseerd mat materiaal in steriele verpakking van de Waring blender, voeg ongeveer 100 ml 1 M NaCl (of een concentratie die specifiek zijn voor monster in gebruik) en mix drie keer op de middelste stand gedurende 1 minuut met intermitterende koeling in een -20 ° C vriezer voor 1 minuut. Breng de slurry in een 250 ml centrifuge fles en vul de resterende lege ruimte met 1 M NaCl. Bereid NaCl-oplossing in geautoclaveerd DI-water en filter steriliseren het.
2. Verder los van de microbiële....

Discussion

Gezien het feit dat de totale cel verwijdering uit complex en zeer diverse microbiële mat monsters niet praktisch is, de primaire zorg is hoe goed de uitgepakte de cellen van het totale microbiële mat gemeenschap te vertegenwoordigen. In een eerdere studie, PCR-DGGE analyse van microbiële 16S rRNA genen toonde aan dat de vijf cel verwijderen van de stappen in dit protocol gebruikte cellen die representatief zijn voor de totale microbiële mat gemeenschap ⁷ extracten. Het werkelijke aantal cel-extractie stappen.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het reagens	Vennootschap	Catalogus nummer	Reacties
β-mercapto-ethanol	Sigma-Aldrich	M3148
Polyethyleen glycol 8000	Promega	V3011	20% in 1,2 M NaCl
Kaliumacetaat	Fisher Scientific		Fisher Scientific
Quant-iT dsDNA Assay kit	Invitrogen	Q33130
RNase	Epicentrum	MRNA092
Natrium Chloride	BDH Chemicals	BDH8014	Geschikte conc.
Natriumdodecylsulfaat	Fisher Scientific	03-500-509	10% in water
natriumhexametafosfaat	Merck Chemicals	SX0583-3	2% in water
TBE	Fisher Scientific	BP1333-1
CHEF Mapper XA-systeem	Bio-Rad Laboratories	170-3670
NanoDrop 1000 spectrofotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Vortexer	Wetenschappelijke Industries Inc
Ultraviolet Crosslinker	UVP
Waring blender	Waring laboratorium	LB10S