Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay
Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Prozess-und Screen-Bereich gesammelt Mücken für eine Vielzahl von Viren durch Vero-Zellkultur-Assay. Durch den Einsatz dieser Technik haben wir 9 verschiedene Viren aus 4 taxonomische Familien erkannt in Mücken in Connecticut gesammelt.
Abstract
Mücken übertragen eine Reihe von unterschiedlichen Viren, einschließlich wichtiger menschlicher Krankheitserreger wie West-Nil-Virus, Dengue-Virus, und chickungunya Virus. Viele dieser Viren haben in ihrer endemischen Bereichen intensiviert und ausgebaut, um neue Gebiete, erfordern eine effiziente Überwachung und Steuerung Programme, um diese Bedrohungen zu reagieren. Eine Strategie zur Virus-Aktivität zu überwachen ist das Sammeln von einer großen Anzahl von Moskitos aus endemischen Standorte und testen sie für die virale Infektion. In diesem Artikel beschreiben wir, wie in der Handhabung, Verarbeitung und Display Mücken auf infektiöses Virus von Vero-Zellkultur-Assay-Feld-gesammelt. Mücken werden durch trap Lage und Arten sortiert, gruppiert und in Pools mit ≤ 50 Personen. Pooled Proben werden in Kochsalzlösung mit einem Mixer-Mühle und die wässrige Phase auf konfluente Vero-Zellkulturen (Clone E6) inokuliert homogenisiert. Die Zellkulturen werden für zytopathischen Wirkung vom Tage 3-7 post-Impfung und keine Viren in der Zellkultur gezüchtet durch die entsprechenden diagnostischen Tests identifiziert werden überwacht. Durch die Verwendung dieses Ansatzes haben wir 9 verschiedene Viren aus Moskitos in Connecticut, USA gesammelt isoliert, und unter diesen, 5 ist bekannt, dass Menschen eine Krankheit verursachen. Drei von diesen Viren (West-Nil-Virus, Potosi Virus und La Crosse-Virus) stellen neue Rekorde für Nordamerika oder der New England Region seit 1999. Die Fähigkeit, eine breite Vielfalt von Viren zu erkennen ist entscheidend für die Überwachung sowohl etablierte als auch neu auftretende Viren in der Mücke Bevölkerung.
Protocol
Discussion
Vero-Zellkultur-Assay dient als eine effektive Methode zur Dynprofeld-Mücken gesammelt für eine Vielzahl von Viren. Dies steht im Gegensatz zu molekularen Methoden, die gezielt eine oder einige wenige Viren von Interesse. Darüber hinaus haben wir festgestellt, dass Vero-Zellkultur-Assay gleich ist, wenn nicht empfindlicher als RT-PCR 7 und versorgt uns mit Virusisolate, dass in unserer Referenz-Sammlung für zukünftige Studien gespeichert werden. Dennoch kann Zellkultur-Systeme nicht angemessen in vielen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken für die wichtigen Beiträge der Drs. John Anderson, Andrew Main und Shirley Tirrell zu dieser Studie. Diese Arbeit wurde zum Teil durch Zuschüsse aus dem Centers for Disease Control and Prevention (U50/CCU116806-01-1) und dem US Department of Agriculture (58-6615-1-218, CONH00768 und CONH00773) unterstützt.
Materials
| Name of reagent/ equipment | Company | Catalog Number |
|---|---|---|
| Fetal bovine serum | Gibco – Invitrogen | 16140 |
| Anti-biotic/mycotic | Gibco – Invitrogen | 15240 |
| Sodium bicarbonate NaHCO3, 7.5% Soln. | Gibco – Invitrogen | 25080 |
| L-Glutamine 200mM 100x | Gibco-Invitrogen | 25030 |
| Powdered minimal essential medium (MEM) | Gibco – Invitrogen | 11700 |
| 10X Dulbecco’s PBS | Gibco – Invitrogen | 14080 |
| Trypsin-EDTA | Gibco – Invitrogen | 15400 |
| Rabbit serum | Gibco – Invitrogen | 16120 |
| Vero Cells (Clone E6) | ATCC | CRL-1586 |
| Small tissue culture flasks, vented caps, 25 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353112 |
| Large tissue culture flasks, vented caps, 175 cm2 | Falcon – Becton Dickinson | 353108 |
| Copper-coated BB’s, 4.5 mm | Crosman | 0767 |
| Mixer Mill | Retsch | MM300 |
| Isopack freezer racks | Eppendorf | 022510240 |
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