Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met Listeria monocytogenes Published: August 9, 2011 doi: 10.3791/3076
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1St Vincent’s Institute, Department of Medicine, The University of Melbourne, 2Department of Microbiology and Immunology, The University of Melbourne

Summary

Listeria monocytogenes is een modelorganisme voor het bestuderen van immuunreacties en de genetische gevoeligheid voor bacteriën intracellulaire bij muizen. Deze methode stelt je in staat om bacteriële lading te meten en single-cell suspensies van de lever en de milt van de muizen voor het genereren van FACS-analyse van veranderingen in het immuunsysteem van cellen als gevolg van Listeria-infectie te bepalen.

Abstract

Listeria monocytogenes (Listeria) is een Gram-positieve facultatief intracellulaire pathogeen 1. Muizen studies meestal intraveneuze injectie van Listeria in dienst, wat resulteert in de systemische infectie 2. Na injectie, Listeria verspreidt snel naar de milt en lever als gevolg van opname door CD8α + dendritische cellen en Kupffercellen 3,4. Eenmaal gefagocyteerd, diverse bacteriële eiwitten kunnen Listeria naar het fagosoom ontsnappen, in het cytosol te overleven, en de naburige cellen infecteren 5. Tijdens de eerste drie dagen van de infectie, de verschillende aangeboren immuun cellen (bijvoorbeeld monocyten, neutrofielen, NK-cellen, dendritische cellen) bemiddelen bactericide mechanismen die Listeria proliferatie te minimaliseren. CD8 + T-cellen worden vervolgens gerekruteerd en verantwoordelijk voor de uiteindelijke klaring van Listeria van de gastheer, meestal binnen 10 dagen na infectie 6.

Succesvolle klaring van Listeria van geïnfecteerde muizen afhankelijk van de juiste begin van de gastheer immuunreacties 6. Er is een breed scala aan gevoeligheden onder inteelt muizenstammen 7,8. Over het algemeen, muizen met een verhoogde gevoeligheid voor Listeria infecties zijn minder in staat om bacteriële proliferatie controle, waaruit blijkt toegenomen bacteriële belasting en / of vertraagde klaring ten opzichte van resistente muizen. Genetische studies, waaronder linkage analyses en knock-out muis stammen, hebben geïdentificeerd verschillende genen die sequentievariatie gastheer reacties treft om Listeria besmetting 6,8-14. Bepaling en vergelijking van de infectie kinetiek tussen de verschillende muizenstammen is dan ook een belangrijke methode voor het identificeren van gastheer genetische factoren die tot immuunreacties bij te dragen tegen Listeria. Vergelijking van de gastheer reacties op de verschillende stammen Listeria is ook een effectieve manier om bacteriële virulentie factoren die kunnen dienen als potentiële doelwitten voor antibiotica of vaccins ontwerp te identificeren.

We beschrijven hier een eenvoudige methode voor het meten van bacteriële belasting (kolonievormende eenheden [CFU] per weefsel) en het voorbereiden van eencellige suspensies van de lever en milt voor FACS-analyse van immuunresponsen bij Listeria-geïnfecteerde muizen. Deze methode is vooral nuttig voor de initiële karakterisering van Listeria-infectie in nieuwe muizenstammen, evenals de vergelijking van de immuunrespons tussen verschillende muizenstammen die besmet zijn met Listeria. We gebruiken de Listeria monocytogenes EGD stam 15 die, wanneer gekweekt op bloed-agar, een karakteristieke stralenkrans rond elke kolonie als gevolg van β-hemolyse 1 (figuur 1) vertoont. Bacteriële belasting en immuunreacties kan worden bepaald op welk tijdstip-punt na de infectie door het kweken van weefsel homogenaat op bloed agar platen en het voorbereiden van weefsel celsuspensies voor FACS analyse met behulp van de hieronder beschreven protocollen. Wij merken dat individuen die immuungecompromitteerd zijn of zwanger bent niet mag Listeria hanteren, en de desbetreffende institutionele bioveiligheid commissie en dier moet het management worden geraadpleegd voordat het werk begint.

Protocol

1. Kweken en op lange termijn opslag van Listeria monocytogenes (Listeria)

  1. Maken of de aankoop pre-en-klare paard bloed-agar (HBA) platen. Droge platen voorafgaand aan de door de pre-incubatie gebruik bij 37 ° C gedurende de nacht of het plaatsen van blootgelegd in een laminaire flow kast voor een uur.
  2. Verkrijgen levensvatbare Listeria van een van de volgende: een geïnfecteerd muis weefsel homogenaat, een gevriesdroogd voorraad, een bevroren glycerol voorraad, of een kolonie uit een recent Listeria cultuur (dat wil zeggen minder dan een week oud en niet sub-gekweekte meer dan 10 generaties) . Alle Listeria moet worden verkregen met behulp van een steriele entnaald en met gebruikmaking van aseptische technieken voor alle methoden beschreven in dit protocol.
  3. Streak Listeria op een HBA plaat zoals weergegeven in figuur 1 met behulp van een steriel entnaald: streak Listeria op ¼ van de plaat oppervlak als het primaire inoculum te verspreiden. Maak een serie van unidirectionele strepen van de primaire verspreiden. Herhaal strepen 2-3 keer met een verse of opnieuw gesteriliseerd lus voor elke set van strepen. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende de nacht.
  4. Store Listeria HBA plaat staan ​​bij 4 ° C voor een periode van maximaal een maand of ga naar 1.5 stap om Listeria cultuur voor te bereiden op de lange termijn opslag.
  5. Kies een enkele kolonie uit een nieuw Listeria cultuur op een HBA plaat met behulp van een gesteriliseerde entnaald en enten 10 ml van de hersenen het hart infusie (BHI) bouillon (voor te bereiden volgens de instructies van de fabrikant) in een 30 ml flesje McCartney.
  6. Incubeer de Listeria cultuur in een rondschudapparaat op 180rpm bij 37 ° C gedurende de nacht.
  7. Voeg steriele 80% glycerol (v / v) om vloeibaar Listeria cultuur in verhouding van 1:1 tot een uiteindelijke concentratie van glycerol 40% (v / v) te verkrijgen. Overdracht 0,5-1 ml aliquots in cryovials en op te slaan Listeria / glycerol voorraden bij -70 ° C.

Tips & Opmerkingen:

  • Groei van Listeria kunnen worden ondersteund op verschillende niet-selectieve media, zoals een reeks van bloed-agar (aangevuld met paarden, schapen, cavia of menselijk bloed), de hersenen het hart infusie (BHI) agar of bouillon, of tryptische soja bouillon met gist extract (TSB-YE). Vervuilende groei kan worden geminimaliseerd in de cultuur door het toevoegen van antibiotica tot de media voor Listeria-stammen met bepaalde antibiotica-resistentie (bv. L. monocytogenes 10403S), of met behulp van Oxford media, die selectief de groei van Listeria.
  • Als Listeria is verkregen uit een niet-geteste bron, is het raadzaam dat aanvullende tests worden uitgevoerd om de identiteit van de te bevestigen Listeria (L. monocytogenes is Gram-positieve, niet-sporenvormende, beweeglijk op <30 ° C, facultatief anaërobe, catalase positief en oxidase negatief). De verkregen cultuur kan ook worden geteeld op Listeria selectieve media om ervoor te zorgen dat een reincultuur wordt verkregen.
  • Het drogen van de HBA platen zorgt ervoor dat er een optimale scheiding van bacteriële kolonies op de plaat.
  • Bij het ​​maken van bevroren glycerol voorraden van Listeria, gebruik van verse HBA Listeria culturen die minder dan 1 week oud en sub-gekweekt voor zo weinig generaties lang als mogelijk (<5 is het beste).
  • Bij het ​​afleiden van verse Listeria culturen uit een bevroren glycerol voorraad, moet de eerste passage worden gemaakt op een vast medium (dat wil zeggen platen HBA), omdat Listeria die van bevroren glycerol voorraden groeien slecht als direct subcultuur in vloeibaar medium.

2. Bereiding en opslag van Listeria besmettelijke voorraad voor in vivo studies infectie

  1. Streak Listeria uit een bevroren glycerol voorraad (stap 1.7) op een HBA plaat zoals beschreven in stap 1.3. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende de nacht voor gebruik op de volgende dag.
  2. Kies een Listeria kolonie van een streep cultuur en inoculeren een 10 ml BHI bouillon. Voorkomen dat de overdracht van agar in de bouillon.
  3. Incubeer de Listeria BHI cultuur in een orbitale schudder bij 180 tpm en 37 ° C tot midden-logaritmische fase (OD600 = ~ 0.4). Dit duurt meestal 3-4 uur.
  4. Aseptisch Neem een ​​0,9 ml aliquot en het verkrijgen van een OD lezen bij 600 nm op 3-4 uur van te schudden. Als OD lezen is <0,3, ga dan verder met de cultuur in een orbitale schudder bij 180 tpm en 37 ° C tot OD lezen is ~ 0.4.
  5. Voeg 1 mL steriel 80% glycerol (v / v) tot 10 ml Listeria BHI bouillon cultuur (OD600 ~ 0.4). Meng voorzichtig en zetten in 1,5 mL microfugebuizen buizen in 0,5-1 ml porties.
  6. Plaats de monsters op ijs gedurende 10 minuten en bewaar bij -70 ° C. Laat een aliquot vrijgegeven aan de concentratie van Listeria in de besmettelijke voorraad, die typisch is in de orde van 10 9 CFU / mL te bepalen.
  7. Voer 01:10 seriële verdunningen van de unfrozen Listeria besmettelijke voorraad in PBS tot 10 -8 verdunning. Verdeel 100 pi van onverdund en elke volgende verdunning op pre-gedroogde HBA platen (stap 1.1) in duplo uit met een glas spreader. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende de nacht.
  8. Tel het aantal kolonies op elk bord en bepalen de Listeria concentratie van de bevroren besmettelijke voorraad culture met behulp van de volgende berekening: concentratie (CFU / ml) = aantal kolonies x verdunningsfactor / 0,1 ml. De platen gekozen voor het tellen van Idealiter moet 30-300 kolonies om een ​​betrouwbare schatting van de CFU concentratie van levensvatbare bacteriën te garanderen.
  9. Een paar dagen na het opslaan van Listeria besmettelijke voorraad bij -70 ° C, ontdooien een buis. Bepaal de concentratie van levensvatbare Listeria, zoals beschreven in de stappen 2.7 en 2.8. Deze concentratie moeten vergelijkbaar zijn met die bepaald voor de vers bereide besmettelijke voorraad in stap 2.8.

Tips & Opmerkingen:

  • Listeria besmettelijke voorraad is bevroren op een lager percentage glycerol (8%) dan voor Listeria bevroren voor algemene opslag op lange termijn (40%).
  • Bevroren Listeria besmettelijke voorraden zijn meestal stabiel bij -70 ° C voor maximaal 3 maanden. Bij gebruik van meer dan 3 maanden, is het aanbevolen dat een nieuwe besmettelijke voorraad worden bereid uit een verse Listeria cultuur op een HBA plaat.
  • Als de concentratie van de ontdooide Listeria besmettelijke voorraad (stap 2.9) verschilt van de vers bereide aandelen zoals beschreven in stap 2.7 en 2.8 (dwz> 20% daling van de CFU), dan is een nieuwe besmettelijke ingevroren voorraad moet worden voorbereid.
  • Hoewel het in eerste instantie meer tijd in beslag dan het opstellen van een verse bacteriecultuur inoculum voor een experiment, het opstellen van bevroren Listeria besmettelijke voorraden maakt nauwkeurige bepaling van de CFU concentratie voorafgaand aan de infectie en een betere samenhang tussen experimenten bij muizen geïnfecteerd zijn van dezelfde bevroren voorraad.

3. Voorbereiding van Listeria inoculum en intraveneuze injectie van muizen

  1. Bepaal de concentratie van Listeria in te spuiten per muis. Voor intraveneuze injectie wordt CFU in 200 pi inoculum per muis gebruikt.
  2. Ontdooi een bevroren fractie van Listeria besmettelijke voorraad (uit stap 2.6). Verdun de besmettelijke voorraad in PBS om de gewenste Listeria CFU concentratie. Verdubbel de hoeveelheid die nodig is voor het injecteren van alle muizen om ervoor te zorgen dat er genoeg is inoculum voor injectie en de bepaling van de Listeria CFU pre-en post-injectie (stap 3.3 en 3.7).
  3. Verwijder 2x 0,1 ml porties van de voorbereide Listeria inoculum, en van een 1:10 verdunning in PBS voor elk aliquot voor injectie van de muizen. Plaat 0,1 ml van elke verdunning op HBA borden, en 's nachts Incubeer de platen bij 37 ° C. Tel het aantal kolonies en bepalen de pre-injectie concentratie van de Listeria inoculum: concentratie (CFU / ml) = (aantal kolonies x verdunningsfactor) / mL plated voor die verdunningsfactor.
  4. Breng de muis te worden geïnjecteerd in een schone kooi. Warm de muis door het plaatsen van de kooi ~ 50 cm onder een 250 watt infrarood lamp gedurende 5 min (andere geschikte thermische apparaten die niet zal branden van de muis of de temperatuur van de kooi boven de 40 ° C kan ook gebruikt worden). Plaats de muis in een beveiligingssysteem voor de staartader injecties.
  5. Meng de Listeria schorsing om een consistente suspensie te houden elke keer een spuit wordt geladen.
  6. Zoek de laterale staartader van de muis, veeg met een 70% ethanol af te vegen en te injecteren 200 pi van de Listeria inoculum (op de gewenste concentratie) met behulp van een injectiespuit met een 27 gauge naald. Kort van toepassing zijn druk om toegang wond met een steriel gaasje. Zet de muis aan zijn kooi.
  7. Wanneer de injectie van alle muizen is afgerond, herhaalt u stap 3.3 met behulp van het resterende bedrag van inoculum op de post-injectie concentratie van de Listeria inoculum vast te stellen.
  8. De hoeveelheid Listeria geïnjecteerd in muizen wordt gerapporteerd als de gemiddelde CFU bepaald op basis van de pre-en post-injectie Listeria inoculum monsters.

Tips & Opmerkingen:

  • We meestal injecteren 500 - 3000 CFU (200 pi van 2.500 CFU / mL - 15.000 CFU / ml inoculum) bij het vergelijken van bacteriën en immuunreacties tussen een resistente muizenstam (bijv. C57BL / 6) en een gevoelige muizenstam (bijv. BALB / c ).
  • Als de besmettelijke aandelen zal worden verdund in PBS met ten minste 10 5, dan is een wasstap principe niet nodig is om de resterende media / glycerol te verwijderen. Als de besmettelijke voorraad zal niet worden verdund in PBS met ten minste 10 5, dan is een wasstap moet worden toegevoegd in stap 3.2 tot en met resterende media / glycerol te verwijderen als volgt: Add 9 mL PBS aan ontdooide besmettelijke voorraad en bacteriën verzameld door centrifugering bij 2100 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder supernatant en resuspendeer de gepelleteerde bacteriële cellen in 10 ml steriele PBS, herhalen centrifugeren, en resuspendeer de bacteriële cel pellet in het gewenste volume. Bepaal de gemiddelde CFU uit de pre-en post-injectie Listeria inoculum monsters zoals beschreven in stap 3.3 en 3.7. Opgemerkt wordt dat deze wasstap kan resulteren in een verlies van bacteriën, en het is aan te bevelen dat een dergelijk verlies vooraf worden vastgesteld en verantwoord in het maken van de inoculum van de vereiste concentratie.
  • Veilig te ontdoen van spuit en naald na het injecteren van muis met Listeria.

4. Verwijdering van de lever en milt van de Listeria-geïnfecteerde muizen voor analyse

  1. Euthanase de geïnfecteerde muis op het gewenste tijdstip na infectie met behulp van een methode goedgekeurd door de lokale Dier Ethische Commissie, zoals CO 2 stikken.
  2. Voer cardiale bloeden onmiddellijk na euthanasie met behulp van een 1 ml spuit en 25 gauge naald. Verzamel zo veel bloed als mogelijk. Verwijder de galblaas en verbreken van de vena cava inferior.
  3. Expose de lever poortader door zorgvuldig te duwen darmen aan de rechterkant, draait u de lever kwabben in de richting van het hoofd en naar links, zodat de lever zit, waar het membraan zich bevindt. De lever poortader voert in de onderkant van de lever uit de onderste rechterkant.
  4. Perfuseren de lever door het injecteren van 10 ml PBS in de lever poortader met behulp van een 26 gauge naald. PBS ingespoten via de poortader zal verlaten de afgehakte vena cava inferior. Leverperfusie zorgt ervoor dat geoogste cellen zijn afkomstig uit de lever en niet het circulerende bloed.
  5. Verwijder de geperfuseerde lever uit het lichaam van de muis holte, plaats in de FACS-buffer, en op te slaan op het ijs. Ga naar 5.1 stap voor de voorbereiding van de lever voor FACS-analyse.
  6. Haal de milt van de muis, plaats in FACS-buffer, en op te slaan op het ijs.
  7. Het geheel wegen milt, in tweeën gesneden, en wegen op een van de helften. Plaats een half in FACS-buffer en ga naar 6.1 stap. Leg de andere helft in een Stomacherzakje op ijs en ga naar 7.1 stap.

Tips & Opmerkingen:

  • In stappen 4.5 en 4.6, het gebruik voldoende FACS buffer om volledig onder te dompelen het weefsel om de blootstelling van enig deel van het weefsel aan de lucht te minimaliseren.
  • Een ½ inch lengte 26 gauge naald die wordt gebogen door ~ 30 graden kan de injectie van PBS beter te faciliteren in de lever poortader.
  • Wanneer doorbloed goed, de lever verandert van een donkere rode kleur tot lichtbruin na het injecteren van 1-2 ml PBS.
  • Als de lever is niet vereist voor FACS-analyse, perfusie is niet nodig. De lever kan worden geïsoleerd en direct verzameld in een Stomacherzakje en verwerkt zoals beschreven in stap 7.
  • Voor euthanasie van muizen, CO 2 stikken is de voorkeur omdat het een minimale impact op bacteriële CFU en immuunsysteem levensvatbaarheid van de cellen in de milt en lever. Indien bloedafname niet nodig is, kan cervicale dislocatie als alternatief worden gebruikt euthanasie methode. Het wordt aanbevolen dat euthanasie methoden die gewicht van de organen of immuun levensvatbaarheid van de cellen kunnen beïnvloeden niet worden gebruikt (bijv. thiobarbiturates).

5. Voorbereiding van de lever celsuspensie voor FACS-analyse

  1. Het genereren van single-cell suspensies door het plaatsen van de lever met FACS buffer (stap 4.5) in een 70 um cel filter dat zich in een 60 mm petrischaal. Duw het weefsel door de cel zeef met behulp van de zuiger van een 5 ml spuit totdat er een single-cell suspensie wordt gevormd.
  2. Breng de lever single-celsuspensie van de petrischaal met een 50 ml conische schroefdop tube en breng het totale volume met 40 ml koud FACS buffer.
  3. Vortex celsuspensie en neem een ​​1 ml aliquot van bacteriële belasting voor de lever te bepalen. Ga naar 7.3 stap en dit 1 ml aliquot gebruiken in plaats van weefsel homogenaat in Stomacherzakje.
  4. Pellet cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 min bij 4 ° C, bovenstaande, hersuspenderen pellet gooi in 40 ml koud FACS-buffer, pellet van de cellen door centrifugatie bij 500 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, en gooi supernatant.
  5. Resuspendeer de cel pellet in 20 ml isotone Percoll bij kamertemperatuur. Centrifugeer celsuspensie bij 700 xg gedurende 12 min bij kamertemperatuur. Gooi supernatant en disc-achtige plaat van cellen drijven op de top (ie hepatocyten). Resuspendeer de leukocyten-bevattende pellet in 4 mL TAC buffer aan erytrocyten en incubeer cellen lyseren bij kamertemperatuur maximaal 10 minuten met frequente inversie.
  6. Filter celsuspensie door middel van een 100 um nylon membraan in een nieuwe 10 ml centrifugebuis.
  7. Onderlaag gefilterd celsuspensie met 1 ml FCS / EDTA-buffer. Centrifugeer bij 350 xg gedurende5 min bij 4 ° C ligt, doe bovenstaande, en resuspendeer in 5 ml FACS / EDTA-buffer.
  8. Centrifugeer celsuspensie bij 350 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C ligt, doe bovenstaande, en resuspendeer celpellet in 0,5-3 ml FACS / EDTA-buffer afhankelijk van de grootte van de korrel.
  9. Verdunnen celsuspensie 1u05-tot-1:20 in trypan blauw, afhankelijk van opschorting volume in stap 5.8. Count levensvatbare lever leukocyten met behulp van hemacytometer (Figuur 4A) en het vaststellen van totaal levensvatbare cellen als volgt uit: levensvatbare cellen / orgel = aantal cellen in het tellen gebied x verdunningsfactor x 10 4 x volume (ml). Lever single-cell suspensies kan vervolgens worden gemerkt met antilichamen die specifiek zijn voor de gewenste cel-oppervlak van markers en geanalyseerd door FACS.

Tips & Opmerkingen:

  • Houden cellen op ijs, tenzij anders aangegeven.

6. Voorbereiding van de milt single-cell suspensie voor FACS-analyse

  1. Het genereren van single-cell suspensies door het plaatsen van een helft van de milt (stap 4.7) met FACS buffer in een 70 um cel filter dat zich in een 60 mm petrischaal. Duw het weefsel door de cel zeef met behulp van de zuiger van een 5 ml spuit totdat er een single-cell suspensie wordt gevormd.
  2. Breng de milt single-celsuspensie van de petrischaal met een 10 ml centrifugebuis en brengen het totale volume tot 10 ml met behulp van koud FACS-buffer.
  3. Pellet cellen door centrifugatie bij 350 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C, gooi supernatant, hersuspenderen celpellet in 4 mL TAC buffer naar erytrocyten, en incubeer cellen lyseren bij kamertemperatuur maximaal 10 minuten met frequente inversie.
  4. Filter celsuspensie door middel van een 100 um nylon membraan in een nieuwe 10 ml centrifugebuis.
  5. Onderlaag gefilterd celsuspensie met 1 ml FCS / EDTA-buffer. Centrifugeer bij 350 xg gedurende 5 min bij 4 ° C ligt, doe bovenstaande, en resuspendeer celpellet in 5 ml FACS / EDTA-buffer.
  6. Centrifugeer celsuspensie bij 350 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C ligt, doe bovenstaande, en resuspendeer celpellet in 3-8 ml FACS / EDTA-buffer afhankelijk van de grootte van de korrel.
  7. Verdunnen celsuspensie 1u10-01u20 in trypan blauw (0,4% in gedestilleerd water), afhankelijk van opschorting volume in stap 7.6. Count levensvatbare splenocyten met behulp van hemacytometer - zie stap 5.9 voor de berekening van de totale levensvatbare cellen per orgaan Spleen single-celsuspensies kan vervolgens worden gemerkt met antilichamen die specifiek zijn voor de gewenste cel-oppervlak van markers en geanalyseerd door FACS.

Tips & Opmerkingen:

  1. Houden cellen op ijs, tenzij anders aangegeven.

7. Meting van de bacteriële belasting in weefsels van Listeria-geïnfecteerde muizen

  1. Vouw de bovenkant van de Stomacher zak met de milt half. Terwijl u de Stomacherzakje sluiten om lekkage te voorkomen, legt u deze plat op een schone bank of in een laminaire flow kast. Rol een dikke ronde pen over het weefsel tot het weefsel is puree in de zak.
  2. Voeg 5 ml PBS aan elk Stomacher zak met mashed weefsel. Plaats de Stomacherzakje in de Stomacher, en voer het Stomacher op hoge snelheid gedurende 10 minuten.
  3. Meng de homogenaat in de Stomacherzakje (of de 1 ml van de lever celsuspensie) met een pipet. Voer de volgende in de duplicaten. Transfer 300 pi van een 96-well vlakke bodemplaat. Binnen de putten van de 96-well plaat presteren 01:10 seriële verdunningen (30 pL in 270 pi PBS) om een 10 -5 verwatering voor elk weefsel homogenaat monster.
  4. Zorgvuldig te verspreiden 0,1 ml van elke verdunning op een pre-gedroogde HBA plaat met een glazen strooier. Incubeer de platen bij 37 ° C gedurende de nacht.
  5. Tel het aantal CFU voor elke verdunning en het berekenen van de CFU per weefsel, rekening houdend met het gedeelte van het weefsel (bijvoorbeeld een half milt), verdunningsfactor, en het totale volume van het weefsel homogenaat (5 ml of 40 ml): CFU / weefsel = CFU/0.1 mL x verdunningsfactor x mL / weefsel, voor milt delen dit getal door het percentage gewicht van de milt monster wordt gebruikt voor de homogenisering weefsel (zie stap 4.7).

Tips en opmerkingen:

  • Meer dan een Stomacherzakje kan worden geplaatst in de Stomacher op een moment, zolang het totaal volume niet groter is dan het maximale volume zoals gespecificeerd door de fabrikant
  • Als een Stomacher niet beschikbaar is, kan een weefsel homogeniseerapparaat plaats daarvan worden gebruikt. Als alternatief kan de volgende methode, hoewel niet zo efficiënt, ook gebruikt worden om handmatig maceraat het orgel in de plaats van de stappen 7.1 en 7.2: plaats orgel in een afgesloten plastic zak gesteriliseerd en lag op een schone bank terwijl u de zak dicht om lekkage te voorkomen . Herhaaldelijk rollen een 500 ml laboratorium glazen fles in de zak totdat het weefsel is goed gestampt zijn. Voeg 5 ml PBS op elke zak en ga verder met stap 7.3.
  • Het is heel belangrijk in stap 7.4 dat het HBA platen goed worden gedroogd(Dwz geen vocht op de agar). Anders kan het moeilijk zijn om verschillende Listeria kolonies die goed kunnen worden geteld te krijgen.
  • Als er beperkte HBA platen, een andere maatregel 7.4 is: Teken lijnen op de bodem van een pre-gedroogde HBA plaat (stap 1.1) om het te verdelen in vijf tot zes secties, een voor elke verdunning. Zorgvuldig pipet 25 pi van elke verdunning in de overeenkomstige hoofdstukken over de HBA plaat voor elk weefsel homogenaat - niet verspreid dit met een spreader. Wacht tot druppels weefsel homogenaat droog zijn voordat het omkeren van de plaat. Incubeer plaat bij 37 ° C gedurende de nacht. Tot 80 kolonies kunnen als gevolg van een druppel op een agarplaat worden onderscheiden.
  • Verdunning van weefsel homogenaten kan afhangen van de groei van Listeria het dier en kan worden geschat op basis van de symptomen van het dier op het moment van euthanasie. Voor muizen die merkbaar ten dode opgeschreven, dan is extra verdunningen kan nodig zijn om meer nauwkeurig te bepalen de bacteriële verontreiniging. Voor muizen ingeënt met een lage dosis Listeria of muizen euthanasie aan het eind van de infectie periode, kan onverdund weefsel homogenaat worden gebruikt om de bacteriële verontreiniging te bepalen.
  • Platen kunnen worden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende de nacht of bij kamertemperatuur gedurende 2-3 dagen.

8. Representatieve resultaten:

Voor een standaard-infectie experiment werd Listeria verkregen uit een bevroren glycerol voorraad en strepen op een HBA plaat zoals weergegeven in figuur 1. Als er maar weinig kolonies worden verkregen na strepen, kan dit duiden op een slechte strepen of een minder dan optimaal bevroren voorraad. Een Listeria besmettelijke voorraad werd bereid uit een vers weggeschoten HBA plaat en opgeslagen bij -70 ° C. Voor het meten van bacteriële opruiming en immuunreacties, we routinematig verdunnen de ontdooide Listeria besmettelijke voorraad tot 2500 CFU / mL - 15.000 CFU / ml en injecteren muizen met 200 pi om ze te infecteren met 500 - 3000 CFU. Wij stellen vast dat muizen die besmet zijn met sub-dodelijke doses van Listeria gebruik van dit protocol kan tijdelijk gegolfde vacht, gebogen houding en gewichtsverlies vertonen in de eerste paar dagen. Deze symptomen geven een visuele aanwijzing over hoe ernstig een individu muis is aangetast door de infectie, of het anders reageert op de rest van de groep (dat wil zeggen een "duidelijk" outlier), en de vraag of euthanasie is noodzakelijk om buitensporig leed en de naderende dood te voorkomen als gevolg van de infectie.

In de resultaten vertegenwoordigd door de figuren 2-5, werden muizen geïnfecteerd met behulp van een vers ontdooide hoeveelheid van Listeria besmettelijke voorraad. Op verschillende tijdstippen na infectie werden de muizen geëuthanaseerd en de lever en de milt zijn verwijderd. Figuur 2 toont een HBA plaat waarop verdund milt homogenaat van een enkele muis werd gekweekt. Er moet een duidelijke vermindering van het aantal kolonies worden als de verdunningsfactor hoger komt te liggen, zodanig dat het tellen van verschillende CFU mogelijk is voor ten minste twee verdunningen. Als de muis is verdwenen de Listeria-infectie (dat wil zeggen detectielimiet = 100 CFU / weefsel), dan <5 Listeria kolonies zal aanwezig zijn op de HBA plaat die werd verspreid met 200 pi van onverdunde weefsel homogenaat. Als de lever en / of milt raken besmet met darm-of andere externe bacteriën tijdens isolement, de kolonies op de HBA plaat hebben waarschijnlijk een verschillende morfologie (dat wil zeggen zal niet karakteristieke halo-en bleke kleur van Listeria koloniën) en / of kunnen vertonen verschillend in kolonie telt tot wat verwacht voor Listeria (dat wil zeggen te weinig of te veel). Figuur 3 toont een typische Listeria ruimte curve voor C57BL / 6 muizen - er rekening mee dat Listeria typisch sneller gewist uit de milt dan de lever en de klaring gebeurt niet tot vijf dagen na infectie.

Figuur 4 toont celtellingen op basis van single-cell suspensies bereid uit de milt en de lever van geïnfecteerde muizen op verschillende tijdstippen na infectie. Deze methode kan bereiken> 95% zuiverheid leukocyten in single-cell suspensies bereid uit lever en> 80% van de milt. Leukocyten zuiverheid kan worden bepaald door FACS analyse met behulp van een monoklonaal antilichaam dat specifiek is voor de pan-leukocyten marker CD45 (kloon 30-F11). Typisch, het aantal splenocyten en lever leukocyten stijgen in de periode die nodig is om het virus te klaren met de lever vertonen een grotere voudige toename in de lever leukocyten, maar een aanzienlijk kleinere totaal, in vergelijking met de toename van splenocyten in de milt. Het type en aantal van de immuuncellen kan worden bepaald door het labelen van de single-celsuspensies met antilichamen die specifiek zijn voor het celoppervlak markers. Gelabelde cellen kunnen vervolgens worden gedetecteerd door FACS-analyse. Figuur 5 geeft representatieve resultaten voor de CD8 + T-cellen. Tijdens een standaard Listeria-infectie in C57BL / 6 muizen, is het aantal CD8 + T-cellen daalt tijdelijk als gevolg van lymfopenie in de milt op dag 2-3 before toenemende merkbaar vanaf dag 5 na infectie in zowel de milt en lever.

Figuur 1
Figuur 1. HBA plaat weggeschoten met Listeria. Een steriele entnaald werd gebruikt om de strook Listeria uit een bevroren glycerol voorraad. De plaat werd geïncubeerd bij 37 ° C gedurende de nacht. De karakteristieke halo rondom individuele kolonies te wijten is aan β-hemolyse.

Figuur 2
Figuur 2. Tissue homogenaat van een Listeria-geïnfecteerde muizen gekweekt op HBA platen. Een lever was geoogst uit een listeria-infectie C57BL / 6 muis op 3 dagen na de infectie. Tissue homogenaat werd voorbereid en verdunningen geplaatst als 100 ul volledige plaat verspreid worden voor 10 -4 verdunning (A) en 10 -5 verdunning (B), evenals 25 ul druppels op een HBA plaat voor elke 1:10 verdunning van onverdund tot 10 -5 (C). De platen werden geïncubeerd bij 37 ° C gedurende de nacht. De verdunningen die ervoor zorgen dat het tellen van individuele kolonies worden gebruikt om de bacteriële belasting (dat wil zeggen CFU / weefsel) op dat tijdstip na infectie te bepalen.

Figuur 3
Figuur 3. Listeria belasting in milt en lever van geïnfecteerde C57BL / 6 muizen op 3 en 7 dagen na de infectie. C57BL / 6 muizen werden besmet met ~ 2000 CFU van Listeria. Op elk tijdstip, werden muizen geëuthanaseerd, de lever was perfusie en geoogst met de milt, en verdunningen van de milt homogenaat (A)-of leverinsufficiëntie single-cell suspensie (B) werden gekweekt op HBA platen om de bacteriële verontreiniging te bepalen. Doorgetrokken lijnen geven meetkundig gemiddelde, en de verticale balken geven de SEM. De gestippelde lijn geeft aan dat de detectiegrens voor een nauwkeurige meting van de bacteriële belasting is 100 CFU / orgel voor dit experiment.

Figuur 4
Figuur 4. Levensvatbare cellen telt voor weefsels van geïnfecteerde muizen. C57BL / 6 muizen werden besmet met ~ 2000 CFU van Listeria. Op elk tijdstip, werden muizen geëuthanaseerd, de lever perfusie en geoogst met de milt. Cellen werden gekleurd met trypan blauw en geteld met behulp van een hemacytometer zoals beschreven in stap 5.9 (A). Splenocyten (B) en lever leukocyten (C) telt verkregen uit eencellige suspensies bereid uit Listeria-geïnfecteerde muizen. Lijnen duiden geometrisch gemiddelde.

Figuur 5
Figuur 5. FACS-analyse van CD8 + T-cellen in de Listeria-geïnfecteerde muizen. C57BL / 6 muizen werden besmet met ~ 2000 CFU van Listeria. Op elk tijdstip, werden muizen geëuthanaseerd, de lever perfusie en geoogst met de milt. Single-celsuspensies werden gekleurd met antilichamen die specifiek zijn voor T-cellen (CD3, TCRβ, CD4, CD8). (A) Representatieve FACS profielen met% CD8 + T-cellen + / - SEM. (B) Totaal CD8 + T-cellen in de milt. (C) Totaal CD8 + T-cellen in de lever.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

De auteurs willen graag Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan en Jonathan Wilksch bedanken voor het advies en reagentia. Dit werk werd gefinancierd door de Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) en de Australische National Health en Medical Research Council (575.552). NW wordt ondersteund door een Australische Postgraduate Award. OW wordt ondersteund door een RD Wright Fellowship van de Australische National Health Medical Research Council.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Horse blood agar base No.2 Oxford Labware CM0271 Preparation of agar base for HBA plates
Horse blood (defibrinated) Oxford Labware HB1000 Add 5-10% to agar base
Brain heart infusion (BHI) broth (10 mL) Oxford Labware TM456
Brain heart infusion dehydrated media Oxford Labware CM1135
96-well flat bottom plate BD Biosciences 353072
70 μm cell strainer BD Biosciences 352350
Small petri dish BD Biosciences 351007
Stomacher 80 biomaster lab system Seward
Plastic Stomacher bags Sarstedt Ltd 86 9924 530
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A3912
FACS buffer 0.1% (w/v) bovine serum albumin in PBS
Isotonic Percoll (33.75% Percoll in PBS) GE Healthcare 17-0891-01 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS makes 100mL isotonic Percoll
TAC Buffer 17mM Tris, 140mM ammonium chloride in distilled water
FCS/EDTA buffer Fetal calf serum with 10mM EDTA
FACS/EDTA buffer FACS buffer + 5mM EDTA
Trypan blue Sigma-Aldrich T6146 0.4% (w/v) in PBS, filter sterilized
2mL Cryovial Greiner Bio-One 121263
27 gauge/1mL insulin syringe Terumo Medical Corp. SS10M2713
Needle Terumo Medical Corp. NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in)
Syringe Terumo Medical Corp. SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wing, E. J., Gregory, S. H. Listeria monocytogenes: clinical and experimental update. J Infect Dis. 185, Suppl 1. S18-S24 (2002).
  2. Conlan, J. W. Early host-pathogen interactions in the liver and spleen during systemic murine listeriosis: an overview. Immunobiology. 201, 178-187 (1999).
  3. Neuenhahn, M., Busch, D. H. Unique functions of splenic CD8alpha+ dendritic cells during infection with intracellular pathogens. Immunol Lett. 114, 66-72 (2007).
  4. Cousens, L. P., Wing, E. J. Innate defenses in the liver during Listeria infection. Immunol Rev. 174, 150-159 (2000).
  5. Hamon, M., Bierne, H., Cossart, P. Listeria monocytogenes: a multifaceted model. Nat Rev Microbiol. 4, 423-434 (2006).
  6. Pamer, E. G. Immune responses to Listeria monocytogenes. Nat Rev Immunol. 4, 812-823 (2004).
  7. Cheers, C., McKenzie, I. F. Resistance and susceptibility of mice to bacterial infection: genetics of listeriosis. Infect Immun. 19, 755-762 (1978).
  8. Garifulin, O., Boyartchuk, V. Listeria monocytogenes as a probe of immune function. Brief Funct Genomic Proteomic. 4, 258-269 (2005).
  9. Gervais, F., Stevenson, M., Skamene, E. Genetic control of resistance to Listeria monocytogenes: regulation of leukocyte inflammatory responses by the Hc locus. J Immunol. 132, 2078-2083 (1984).
  10. Gervais, F., Desforges, C., Skamene, E. The C5-sufficient A/J congenic mouse strain. Inflammatory response and resistance to Listeria monocytogenes. J Immunol. 142, 2057-2060 (1989).
  11. Boyartchuk, V. L. Multigenic control of Listeria monocytogenes susceptibility in mice. Nat Genet. 27, 259-260 (2001).
  12. Boyartchuk, V. The host resistance locus sst1 controls innate immunity to Listeria monocytogenes infection in immunodeficient mice. J Immunol. 173, 5112-5120 (2004).
  13. Pan, H. Ipr1 gene mediates innate immunity to tuberculosis. Nature. 434, 767-772 (2005).
  14. Garifulin, O. Irf3 polymorphism alters induction of interferon beta in response to Listeria monocytogenes infection. PLoS Genet. 3, 1587-1597 (2007).
  15. Hof, H. Virulence of different strains of Listeria monocytogenes serovar 1/2a. Med Microbiol Immunol (Berl. 173, 207-218 (1984).
  16. Wollert, T. Extending the host range of Listeria monocytogenes by rational protein design. Cell. 129, 891-902 (2007).
  17. Lecuit, M. A transgenic model for listeriosis: role of internalin in crossing the intestinal barrier. Science. 292, 1722-1725 (2001).
  18. Marco, A. J. Penetration of Listeria monocytogenes in mice infected by the oral route. Microb Pathog. 23, 255-263 (1997).
  19. Busch, D. H., Vijh, S., Pamer, E. G. Animal model for infection with Listeria monocytogenes. Curr Protoc Immunol. Chapter. 19, 19-19 (2001).
  20. Neuenhahn, M., Schiemann, M., Busch, D. H. DCs in mouse models of intracellular bacterial infection. Methods Mol Biol. 595, 319-329 (2010).
  21. Conlan, J. W., North, R. J. Neutrophils are essential for early anti-Listeria defense in the liver, but not in the spleen or peritoneal cavity, as revealed by a granulocyte-depleting monoclonal antibody. J Exp Med. 179, 259-268 (1994).
  22. Czuprynski, C. J., Brown, J. F., Wagner, R. D., Steinberg, H. Administration of antigranulocyte monoclonal antibody RB6-8C5 prevents expression of acquired resistance to Listeria monocytogenes infection in previously immunized mice. Infect Immun. 62, 5161-5163 (1994).

Tags

Immunologie Listeria intracellulaire bacterie genetische gevoeligheid lever milt bloed FACS-analyse T-cellen
Het meten van bacteriën en immuunresponsen bij muizen geïnfecteerd met<em> Listeria monocytogenes</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, N., Strugnell, R., Wijburg,… More

Wang, N., Strugnell, R., Wijburg, O., Brodnicki, T. Measuring Bacterial Load and Immune Responses in Mice Infected with Listeria monocytogenes. J. Vis. Exp. (54), e3076, doi:10.3791/3076 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter