Summary
Listeria monocytogenes è un organismo modello per studiare le risposte immunitarie e la suscettibilità genetica a batteri intracellulari nei topi. Questo metodo permette di misurare la carica batterica e di generare monocellulari sospensioni del fegato e della milza di topi per l'analisi FACS per determinare cambiamenti nelle cellule del sistema immunitario dovuta a infezione da Listeria.
Abstract
Listeria monocytogenes (listeria) è un batterio Gram-positivo patogeno intracellulare facoltativo 1. Studi sul topo tipicamente impiegano iniezione endovenosa di Listeria, che si traduce in infezione sistemica 2. Dopo l'iniezione, Listeria diffonde rapidamente alla milza e al fegato a causa di assorbimento da parte CD8α + cellule dendritiche e le cellule di Kupffer 3,4. Una volta fagocitati, varie proteine batteriche Listeria consentono di sfuggire alla phagosome, sopravvivono all'interno del citosol, e infettare le cellule vicine 5. Durante i primi tre giorni di infezione, le cellule differenti immunitario innato (es. monociti, neutrofili, cellule NK, cellule dendritiche) mediare i meccanismi battericida che riducono al minimo la proliferazione di Listeria. Cellule T CD8 + vengono successivamente assunti e responsabile per la liquidazione finale di Listeria dal host, in genere entro 10 giorni di infezione 6.
Distanza di successo di Listeria da topi infettati dipende l'insorgenza appropriato di risposta immunitaria 6. Vi è un'ampia gamma di sensibilità tra i ceppi di topi inbred 7,8. In genere, i topi con una maggiore suscettibilità alle infezioni da Listeria sono meno in grado di controllare la proliferazione batterica, dimostrando una maggiore carica batterica e / o clearance ritardata rispetto ai topi resistenti. Studi genetici, comprese le analisi di linkage e ceppi di topi knockout, hanno identificato i geni diversi per i quali variazione di sequenza colpisce risposte serie alle infezioni da Listeria 6,8-14. Determinazione e confronto delle cinetiche di infezione tra i diversi ceppi di topi è quindi un importante metodo per identificare i fattori dell'ospite genetici che contribuiscono alla risposta immunitaria contro Listeria. Confronto di risposte serie a diversi ceppi di Listeria è anche un modo efficace per identificare fattori di virulenza dei batteri che possono servire come potenziali bersagli per la terapia antibiotica o la progettazione di vaccini.
Descriviamo qui un metodo semplice per la misurazione della carica batterica (unità formanti colonia [CFU] tessuto per persona) e la preparazione a cella singola sospensioni del fegato e della milza per l'analisi FACS delle risposte immunitarie in topi infettati con Listeria. Questo metodo è particolarmente utile per la caratterizzazione iniziale di infezione da Listeria in ceppi di topi romanzo, così come il confronto delle risposte immunitarie tra diversi ceppi di topi infettati con Listeria. Usiamo il Listeria monocytogenes EGD ceppo 15 che, se coltivati su agar sangue, presenta una zona caratteristica alone intorno ad ogni colonia a causa di β-emolisi 1 (Figura 1). Carica batterica e le risposte immunitarie possono essere determinati in qualsiasi momento-point dopo l'infezione da tessuto omogenato coltura su piastre di agar sangue e la preparazione delle sospensioni di cellule di tessuto per l'analisi FACS utilizzando i protocolli descritti di seguito. Si segnala che gli individui immunocompromessi o in stato di gravidanza non devono maneggiare Listeria, e il comitato di biosicurezza istituzionali competenti e facility management animale deve essere consultato prima dei lavori.
Protocol
1. Coltura e conservazione a lungo termine di Listeria monocytogenes (listeria)
- Il successo o l'acquisto di pre-made cavallo agar sangue (HBA) piatti. Piatti asciutti prima dell'uso da parte di pre-incubazione a 37 ° C per una notte o di collocamento scoperto in un armadio a flusso laminare per 1 ora.
- Ottenere Listeria praticabile da uno dei seguenti: un tessuto omogenato infetto mouse, uno stock liofilizzato, uno stock di glicerolo congelato, o una colonia da una cultura recente Listeria (cioè meno di una settimana vecchio e non sub-coltura più di 10 generazioni) . Tutti i Listeria dovrebbe essere ottenuto utilizzando un'ansa sterile inoculare ed impiegando tecniche asettiche per tutti i metodi descritti in questo protocollo.
- Streak Listeria su un piatto HBA come mostrato nella Figura 1 con un'ansa sterile inoculazione: striscia Listeria oltre ¼ della superficie della piastra come diffondere l'inoculo primario. Effettuare una serie di striature unidirezionale dalla diffusione primario. Ripetere striature 2-3 volte utilizzando un ciclo freschi o ri-sterilizzati prima di ogni serie di striature. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
- Conservare Listeria piastra HBA a 4 ° C per un periodo massimo di 1 mese o passare al punto da 1,5 a preparare la cultura Listeria per conservazione a lungo termine.
- Scegli una singola colonia da una cultura nuova Listeria su un piatto HBA utilizzando un ciclo sterilizzato inoculazione e inoculare 10 ml di infusione cerebrale cuore (BHI) brodo (prepara secondo le istruzioni del produttore) in un flacone da 30 ml McCartney.
- Incubare la cultura Listeria in un agitatore orbitale a 180rpm a 37 ° C durante la notte.
- Aggiungi sterile glicerolo 80% (v / v) a liquido cultura Listeria in rapporto 1:1 per ottenere una concentrazione finale di glicerolo del 40% (v / v). Trasferimento 0,5-1 aliquote mL in cryovials e conservare scorte di Listeria / glicerolo a -70 ° C.
Consigli & note:
- Crescita di Listeria può essere supportato su diversi non selettivi, come ad esempio una serie di agar sangue (integrata con cavallo, pecora, cavia o sangue umano), il cuore infusione cervello (BHI) agar o brodo o brodo di soia trittico con lievito estratto (TSB-YE). Crescita contaminanti può essere minimizzato nella cultura con l'aggiunta di antibiotici ai media per i ceppi di Listeria con definita resistenza agli antibiotici (es. L. monocytogenes 10403S), oppure utilizzando mezzi di Oxford, che selettivamente sostenere la crescita di Listeria.
- Se Listeria è ottenuto da una fonte non testato, si raccomanda di effettuare ulteriori test per confermare l'identità di Listeria (L. monocytogenes è Gram-positivi, non formano spore, mobili a <30 ° C, anaerobi facoltativi, catalasi positivi, e ossidasi negativi). La cultura ottenuti possono anche essere coltivate su terreni selettivi Listeria per garantire che una coltura pura si ottiene.
- Essiccazione le piastre HBA assicura che ci sia una separazione ottimale di colonie batteriche sulla piastra.
- Quando si effettuano scorte glicerolo congelati di Listeria, utilizzare fresca culture HBA Listeria che sono meno di 1 settimana di vita e sub-coltura per le generazioni meno possibile (<5 è migliore).
- Quando derivanti fresca culture Listeria da uno stock di glicerolo congelato, il primo passaggio deve essere fatta su terreno solido (cioè le piastre HBA), perché ottenute Listeria dalle scorte di glicerolo congelato stentare a crescere quando direttamente subcoltura in mezzo liquido.
2. La preparazione e lo stoccaggio di Listeria magazzino infettive per gli studi in vivo dell'infezione
- Streak Listeria da uno stock di glicerolo congelati (Punto 1.7) su una lastra di HBA come descritto al punto 1.3. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte per il giorno successivo.
- Scegli una singola colonia Listeria da una cultura striscia e inoculare 10 ml di brodo BHI. Evitare di trasferire agar nel brodo.
- Incubare la cultura Listeria BHI in un agitatore orbitale a 180 giri al minuto e 37 ° C a metà fase logaritmica (OD600 = ~ 0,4). Ciò richiede in genere 3-4 ore.
- Prendete un aliquota 0,9 ml in modo asettico e ottenere una lettura OD a 600 nm a 3-4 ore di agitazione. Se OD lettura è <0,3, quindi continuare a cultura in un agitatore orbitale a 180 giri al minuto e 37 ° C fino a quando la lettura OD è ~ 0.4.
- Aggiungere 1 ml di glicerolo sterile 80% (v / v) a 10 ml di Listeria cultura brodo BHI (OD600 ~ 0,4). Mescolare delicatamente e trasferire in provette da 1,5 ml in microcentrifuga 0,5-1 aliquote da ml.
- Posizionare le aliquote in ghiaccio per 10 minuti e conservare a -70 ° C. Lasciare una aliquota scongelato per determinare la concentrazione di Listeria nel magazzino infettive, che in genere è nell'ordine di 10 9 CFU / ml.
- Effettuare diluizioni seriali 1:10 del unfrozen magazzino Listeria infettive in PBS a 10 -8 diluizione. 100 l di diffusione non diluito e ogni successiva diluizione su piastre di pre-essiccamento HBA (passo 1,1) in duplicato utilizzando una spatola di vetro. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
- Contare il numero di colonie su ogni piatto e determinare la concentrazione di Listeria della cultura congelati magazzino infettive utilizzando il seguente calcolo: concentrazione (CFU / ml) = numero di colonie x fattore di diluizione / 0,1 ml. Le piastre di scelta per il conteggio dovrebbe idealmente avere 30-300 colonie per assicurare una stima attendibile della concentrazione CFU di batteri vitali.
- Pochi giorni dopo la memorizzazione Listeria magazzino infettive a -70 ° C, disgelo in un tubo. Determinare la concentrazione di Listeria vitali come descritto ai punti 2.7 e 2.8. Questa concentrazione dovrebbe essere simile a quello determinato per il magazzino appena preparato infettive nel passo 2.8.
Consigli & note:
- Listeria magazzino infettive è congelato in un glicerolo percentuale più bassa (8%) che per Listeria congelati per la generale conservazione a lungo termine (40%).
- Congelati scorte Listeria infettive sono generalmente stabili a -70 ° C per un massimo di 3 mesi. In caso di utilizzo oltre i 3 mesi, si consiglia di un nuovo stock infettive essere preparato da una cultura nuova Listeria su un piatto HBA.
- Se la concentrazione del scongelato magazzino Listeria infettive (punto 2.9) è diverso dal magazzino preparati al momento come descritto ai punti 2.7 e 2.8 (declino cioè> 20% in CFU), poi un nuovo congelate infettive devono essere preparati.
- Anche se il tempo inizialmente più lunghi di preparazione di un inoculo fresco batterica per un singolo esperimento, preparando congelati scorte Listeria infettive permette la determinazione accurata della concentrazione CFU prima infezione e una migliore coerenza tra gli esperimenti quando i topi sono infettate dallo stesso ceppo congelato.
3. Preparazione dell'inoculo Listeria e iniezione endovenosa di topi
- Determinare la concentrazione di Listeria da iniettare per mouse. Per l'iniezione endovenosa, CFU in 200 microlitri inoculo per mouse viene utilizzato.
- Scongelare una aliquota congelata di Listeria magazzino infettive (a partire dal punto 2.6). Diluire il brodo infettive in PBS alla concentrazione desiderata Listeria CFU. Raddoppiare il volume necessario per l'iniezione di tutti i mouse per garantire che ci sia abbastanza inoculo per l'iniezione e la determinazione della Listeria CFU pre-e post-iniezione (passo 3.3 e 3.7).
- Rimuovere 2x 0,1 ml dal inoculo preparato Listeria, e preparare una diluizione 1:10 in PBS per ciascuna aliquota prima dell'iniezione di topi. Piatto 0,1 mL di ciascuna diluizione su piastre HBA, e incubare le piastre una notte a 37 ° C. Contare il numero di colonie e di determinare la pre-iniezione concentrazione dell'inoculo Listeria: concentrazione (CFU / ml) = (numero di colonie x fattore di diluizione) / mL placcato per quel fattore di diluizione.
- Trasferire il mouse per essere iniettato in una gabbia pulita. Caldo il mouse posizionando la gabbia ~ 50 cm sotto una lampada da 250 watt a infrarossi per 5 min (altri dispositivi adatti termica che non brucerà il mouse o aumentare la temperatura della gabbia sopra i 40 ° C può anche essere usato). Posizionare il mouse in un dispositivo di ritenuta per preparazioni iniettabili vena caudale.
- Mescolare delicatamente la sospensione Listeria per mantenere una sospensione costante ogni volta che viene caricata una siringa.
- Individuare la vena laterale della coda del topo, pulire delicatamente con un etanolo al 70% pulire e iniettare 200 ul dell'inoculo Listeria (alla concentrazione desiderata) usando una siringa con un ago da 27 gauge. Brevemente applicare pressione foro di entrata con una garza sterile. Ritorna il mouse per la sua gabbia.
- Quando l'iniezione di tutti i topi è stata completata, ripetere il passaggio 3,3 utilizzando il restante importo di inoculo per determinare la post-iniezione concentrazione dell'inoculo Listeria.
- La quantità di Listeria iniettato in topi viene segnalato come il CFU media determinato dalla pre-e post-iniezione di campioni di inoculo Listeria.
Consigli & note:
- Noi di solito iniettare 500 - 3.000 CFU (200 ml di 2.500 UFC / ml - 15.000 UFC / ml di inoculo) quando si confrontano carica batterica e le risposte immunitarie tra un ceppo di topi resistenti (ad es C57BL / 6) e un ceppo di topi sensibili (ad esempio BALB / c ).
- Se lo stock infettive sarà diluito in PBS da almeno 10 5, poi una fase di lavaggio non è generalmente necessario per rimuovere il supporto residuo / glicerolo. Se lo stock infettive non sarà diluito in PBS da almeno 10 5, poi una fase di lavaggio deve essere aggiunto nel passaggio da 3,2 a rimuovere il supporto residuo / glicerolo come segue: Agg 9 mL di PBS per scongelati magazzino infettive e batteri raccolti per centrifugazione a 2100 xg per 10 minuti a 4 ° C. Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet cellule batteriche in 10 ml di PBS sterile, ripetere la centrifugazione, e risospendere il pellet di cellule batteriche in volume desiderato. Determinare la media CFU dal pre-e post-iniezione di campioni di inoculo Listeria come descritto al punto 3.3 e 3.7. Si osserva che questa fase di lavaggio può causare una perdita di batteri, e si raccomanda che tale perdita è determinato in anticipo e contabilizzati nel fare l'inoculo di concentrazione richiesta.
- Sicuro gettare siringa e l'ago dopo l'iniezione del mouse con Listeria.
4. Rimozione di fegato e milza da Listeria topi infettati per l'analisi
- Euthanase il mouse infetti al punto desiderato tempo dopo l'infezione usando un metodo approvato dal Comitato Etico locale degli animali, come la CO 2 asfissia.
- Eseguire sanguinano cardiaco subito dopo l'eutanasia con una siringa da 1 ml e 25 gauge. Raccogliere il sangue il più possibile. Rimuovere cistifellea e recidere la vena cava inferiore.
- Esporre la vena porta epatica con attenzione spingendo intestini a destra, capovolgere i lobi del fegato verso la testa e verso sinistra in modo che il fegato è seduta in cui il diaframma si trova. La vena porta epatica alimenta nella parte inferiore del fegato dal lato in basso a destra.
- Perfusione del fegato iniettando 10 ml di PBS nella vena porta epatica utilizzando a 26 gauge. PBS iniettato attraverso la vena porta uscirà dal reciso vena cava inferiore. Perfusione del fegato assicura che le cellule raccolte vengono dal fegato e non il sangue circolante.
- Togliere il fegato perfuso dal cavità del corpo del mouse, posto nel buffer FACS, e memorizzare sul ghiaccio. Passare al punto 5.1 per la preparazione del fegato per l'analisi FACS.
- Rimuovere la milza dal mouse, posto nel buffer FACS, e memorizzare sul ghiaccio.
- Pesare la milza interi, tagliati a metà e pesano una delle due metà. Mettere una metà in un tampone di FACS e passare al punto 6.1. Posizionare l'altra metà in un sacchetto Stomacher sul ghiaccio e andare al punto 7.1.
Consigli & note:
- Nei passaggi 4.5 e 4.6, sufficiente uso tampone FACS per sommergere completamente il tessuto per minimizzare l'esposizione di qualsiasi parte del tessuto all'aria.
- Un pollice ½ lunghezza 26 gauge che viene piegato da ~ 30 gradi può meglio facilitare l'iniezione di PBS nella vena porta epatica.
- Quando perfusi correttamente, il fegato si trasforma da un colore rosso scuro al marrone chiaro dopo l'iniezione di 1-2 ml di PBS.
- Se il fegato non è richiesto per l'analisi FACS, perfusione non è necessario. Il fegato può essere isolato e raccolto direttamente in un sacchetto Stomacher e trattati come descritto al punto 7.
- Per l'eutanasia di topi, CO 2 asfissia è il metodo preferito perché ha un impatto minimo sulle CFU batterica e la vitalità delle cellule immunitarie nella milza e nel fegato. Se la raccolta del sangue non è necessario, dislocazione cervicale può essere usato come metodo alternativo eutanasia. Si consiglia di non eutanasia metodi che possono influenzare il peso organo o la vitalità delle cellule immunitarie essere utilizzato (ad es thiobarbiturates).
5. Preparazione della sospensione di cellule epatiche per l'analisi FACS
- Genera cella singola sospensioni mettendo fegato con FACS tampone (passo 4.5) in un colino 70 micron cella che si trova all'interno di un piatto 60 millimetri Petri. Spingere il tessuto attraverso il filtro delle cellule utilizzando lo stantuffo di una siringa da 5 ml fino a cella singola sospensione è formato.
- Trasferire la singola cellula epatica sospensione dalla piastra di Petri di un 50 ml con tappo a vite del tubo e portare il volume complessivo di 40 ml con tampone a freddo FACS.
- Vortex sospensione cellulare e prendere un 1 ml aliquota per determinare carica batterica per il fegato. Passare al punto 7.3 e utilizzare questa aliquota 1 ml al posto di tessuto omogenato in borsa Stomacher.
- Cellule pellet per centrifugazione a 500 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare il surnatante, risospendere pellet in 40 ml di buffer freddo FACS, agglomerare le cellule per centrifugazione a 500 xg per 5 min a 4 ° C, il surnatante e gettarlo.
- Risospendere il pellet cellulare in 20 ml di Percoll isotonico a temperatura ambiente. Centrifugare sospensione cellulare a 700 xg per 12 minuti a temperatura ambiente. Eliminare foglio surnatante e disco-come delle cellule galleggiante sopra (cioè epatociti). Risospendere i leucociti contenenti pellet in 4 mL di tampone TAC per lisare eritrociti e le cellule incubare a temperatura ambiente per un massimo di 10 minuti con inversione frequenti.
- Cellula sospensione filtrare attraverso una membrana di nylon 100 micron in una nuova provetta da 10 ml per centrifuga.
- Underlay filtrata sospensione di cellule con 1 ml FCS / EDTA buffer. Centrifugare a 350 xg per5 min a 4 ° C, scartare il surnatante e risospendere in 5 ml FACS / EDTA buffer.
- Centrifugare sospensione cellulare a 350 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare il surnatante e risospendere pellet di cellule in 0,5-3 mL FACS / EDTA tampone a seconda delle dimensioni del pellet.
- Diluire 1:05-1:20 sospensione cellulare in trypan blu a seconda del volume sospensione in fase 5.8. Conteggio leucociti epatica praticabile utilizzando emocitometro (Figura 4A) e determinare totale cellule vitali come segue: cellule vive / organo = numero di cellule nel conteggio fattore di diluizione x zona x 10 4 x volume (ml). Fegato monocellulari sospensioni possono essere etichettati con anticorpi specifici per la desiderata superficie cellulare marcatori e analizzati da FACS.
Consigli & note:
- Mantenere le cellule in ghiaccio se non diversamente specificato.
6. Preparazione di splenica cella singola sospensione per l'analisi FACS
- Genera cella singola sospensioni mettendo metà della milza (passo 4.7) con tampone FACS in un colino 70 micron cella che si trova all'interno di un piatto 60 millimetri Petri. Spingere delicatamente il tessuto attraverso il filtro delle cellule utilizzando lo stantuffo di una siringa da 5 ml fino a cella singola sospensione è formato.
- Trasferire la cella singola sospensione milza dalla piastra di Petri in una provetta da centrifuga da 10 ml e portare il volume complessivo di 10 ml utilizzando tampone a freddo FACS.
- Cellule pellet per centrifugazione a 350 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 4 mL di tampone TAC per lisare eritrociti, e le cellule incubare a temperatura ambiente per un massimo di 10 minuti con inversione frequenti.
- Cellula sospensione filtrare attraverso una membrana di nylon 100 micron in una nuova provetta da 10 ml per centrifuga.
- Underlay filtrata sospensione di cellule con 1 ml FCS / EDTA buffer. Centrifugare a 350 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare il surnatante e risospendere il pellet in 5 ml FACS / EDTA buffer.
- Centrifugare sospensione cellulare a 350 xg per 5 minuti a 4 ° C, scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3-8 ml FACS / EDTA tampone a seconda delle dimensioni del pellet.
- Diluire 1:10 sospensione di cellule - 1:20 in trypan blu (0,4% in acqua distillata) a seconda del volume della sospensione al punto 7.6. Conte splenociti praticabile utilizzando emocitometro - vedi punto 5.9 per il calcolo totale delle cellule vitali per organo Milza monocellulari sospensioni possono essere etichettati con anticorpi specifici per la desiderata superficie cellulare marcatori e analizzati da FACS.
Consigli & note:
- Mantenere le cellule in ghiaccio se non diversamente specificato.
7. Misura della carica batterica nei tessuti da Listeria topi infettati
- Piegare la parte superiore della borsa contenente la metà Stomacher milza. Mentre si tiene la borsa Stomacher chiuso per evitare perdite, appoggiarlo su una panchina pulita o in una cappa a flusso laminare. Rotolare una penna spessa rotonda sui tessuti fino a quando il tessuto è schiacciato all'interno della borsa.
- Aggiungere 5 ml di soluzione salina in ogni sacchetto Stomacher contenenti tessuto purè. Posizionare il sacchetto Stomacher nel Stomacher, ed eseguire il Stomacher ad alta velocità per 10 minuti.
- Mescolare la omogenato nel sacchetto Stomacher (o l'aliquota 1 ml di sospensione delle cellule epatiche) con una pipetta. Eseguire le seguenti duplicati. Trasferire 300 ml per una piastra da 96 pozzetti fondo piatto. All'interno del pozzetti della piastra a 96 pozzetti eseguire diluizioni seriali 1:10 (30 microlitri in 270 microlitri di PBS) ad una diluizione 10 -5 per ogni campione di tessuto omogenato.
- Cura la diffusione 0,1 mL di ciascuna diluizione su un pre-essiccata piastra HBA utilizzando una spatola di vetro. Incubare le piastre a 37 ° C durante la notte.
- Contare il numero di CFU per ogni diluizione e calcolare i CFU per tessuto tenendo conto della parte del tessuto (per esempio una mezza milza), fattore di diluizione, e il volume totale del tessuto omogenato (5 ml o 40 ml): CFU / tessuto = CFU/0.1 ml x fattore di diluizione x ml / tessuto, per milza dividere questo numero per il peso percentuale del campione di milza utilizzato per l'omogeneizzazione dei tessuti (vedi punto 4.7).
Suggerimenti e note:
- Più di un sacchetto Stomacher possono essere messi in Stomacher alla volta fino a quando il volume complessivo non superi il volume massimo, come specificato dal produttore
- Se un Stomacher non è disponibile, un omogeneizzatore tessuto può essere utilizzato. In alternativa, il seguente metodo, anche se non è efficiente, può anche essere usato per macerare manualmente l'organo al posto di passi 7.1 e 7.2: organo posto in una busta sigillata di plastica sterilizzata e laici su una panchina pulita mentre si tiene la borsa chiusa per evitare perdite . Rotolo di un laboratorio bottiglia di vetro da 500 ml ripetutamente sopra il sacchetto fino a quando il tessuto è completamente schiacciato. Aggiungere 5 mL di soluzione salina in ogni sacchetto e passare al punto 7.3.
- E 'molto importante al punto che le piastre 7,4 HBA essere asciugati completamente(Cioè senza umidità sulla agar). Altrimenti può essere difficile ottenere distinte colonie di Listeria che può essere contato correttamente.
- Se ci sono limitato piatti HBA, un passo alternativa 7.4 è: Disegna linee sul fondo di una pre-essiccata piastra HBA (Punto 1.1) di dividerlo in 5-6 sezioni, una per ogni diluizione. Con attenzione pipetta 25 ml di ciascuna diluizione in sezioni corrispondenti sulla piastra HBA per ogni tessuto omogenato - non si diffondono con una spatola. Attendere fino gocce di tessuto omogenato sono asciutti prima di invertire la piastra. Incubare piastra a 37 ° C durante la notte. Fino a 80 colonie possono essere distinte a causa di una goccia su una piastra di agar.
- Diluizione di omogenati di tessuti può dipendere dalla crescita Listeria nell'animale e può essere stimato sulla base dei sintomi visualizzato l'animale al momento della eutanasia. Per i topi che sono notevolmente moribondo, poi diluizioni addizionali possono essere necessarie per determinare più accuratamente la carica batterica. Per i topi inoculati con basse dosi di Listeria o topi eutanasia al termine del periodo di infezione, tessuto omogenato non diluito può essere usato per determinare la carica batterica.
- Piastre possono essere incubate a 37 ° C durante la notte oa temperatura ambiente per 2-3 giorni.
8. Rappresentante dei risultati:
Per un esperimento di infezione standard, Listeria è stata ottenuta da uno stock di glicerolo congelati e striato su una piastra HBA come mostrato nella Figura 1. Se alcune colonie si ottengono dopo striature, questo può indicare striature poveri o meno ottimale congelate. Uno stock Listeria infettive è stato preparato da un piatto appena striato HBA e conservati a -70 ° C. Per la misura di distanza batteriche e le risposte immunitarie, abbiamo regolarmente diluire il scongelato magazzino Listeria infettive a 2.500 UFC / ml - 15.000 UFC / ml e iniettare topi con 200 ul di infettare con 500 - 3.000 CFU. Osserviamo che i topi infettati con dosi sub-letali di Listeria utilizzando questo protocollo può transitoriamente esibire pelo arruffato, la postura ingobbita e perdita di peso entro i primi giorni. Questi sintomi come riferimento visivo su come gravemente un mouse individuo è influenzato dalla infezione, se risponde in modo diverso al resto del gruppo (cioè un outlier "ovvio"), e se l'eutanasia è necessaria per evitare sofferenze eccessive e di morte imminente a causa dell'infezione.
Nei risultati rappresentato da figure 2-5, i topi sono stati infettati con un aliquota appena scongelato di Listeria magazzino infettive. In diversi momenti dopo l'infezione, i topi sono stati eutanasia e del fegato e della milza sono stati rimossi. La Figura 2 mostra un piatto HBA in cui è stata colta omogenato milza diluito da un mouse. Ci dovrebbe essere una netta riduzione del numero di colonie come il fattore di diluizione diventa più alto, in modo che il conteggio CFU distinti è possibile per almeno due diluizioni. Se il mouse ha autorizzato l'infezione da Listeria (limite di rilevazione ie = 100 UFC / tessuto), poi <5 colonie di Listeria sarà presente sulla piastra HBA che è stato diffuso con 200 ml di omogenato di tessuto non diluito. Se il fegato e / o milza sia contaminato da batteri intestinali o altri esterni durante l'isolamento, le colonie sulla piastra HBA sono suscettibili di esporre diversa morfologia (cioè non avrà alone caratteristico colore giallo e di colonie di Listeria) e / o possono essere diverse nella conta delle colonie a ciò che è previsto per Listeria (cioè troppo pochi o troppi). La figura 3 mostra una tipica curva spazio Listeria per topi C57BL / 6 - notare che la Listeria sono in genere più rapidamente cancellati dalla milza di fegato e che il gioco non accade fino a cinque giorni dopo l'infezione.
La Figura 4 mostra conta delle cellule sulla base di singole cellule sospensioni preparate dalla milza e nel fegato di topi infettati in diversi momenti dopo l'infezione. Questo metodo può raggiungere> purezza del 95% dei leucociti in cella singola sospensioni preparate da fegato e> 80% da milza. Purezza dei leucociti può essere determinato mediante l'analisi FACS utilizzando un anticorpo monoclonale specifico per le reti di leucociti marcatore CD45 (clone 30-F11). Tipicamente, il numero di leucociti e splenociti epatica aumentare durante il periodo necessario per eliminare l'infezione con il fegato che presentano un maggiore aumento volte nei leucociti epatica, ma un totale notevolmente più piccolo, rispetto alla crescita del splenociti nella milza. Il tipo e il numero delle cellule del sistema immunitario può essere determinato mediante l'etichettatura di singola cellula sospensioni con anticorpi specifici per la superficie cellulare marcatori. Cellule marcate possono poi essere rilevate tramite analisi FACS. Figura 5 fornisce risultati rappresentativi per cellule T CD8 +. Durante una normale infezione da Listeria nei topi C57BL / 6, il numero di cellule T CD8 + riduce transitoriamente a causa linfopenia nella milza a giorni 2-3 before aumentando notevolmente dal 5 ° giorno post-infezione sia nella milza e nel fegato.
Figura 1. Piastra HBA striato di Listeria. Un ciclo sterile inoculazione è stata utilizzata per striscia Listeria da uno stock di glicerolo congelato. La piastra è stata incubata a 37 ° C durante la notte. Il caratteristico alone che circonda le singole colonie è dovuto alla β-emolisi.
Figura 2. Tessuto omogenato da una infezione da Listeria topo coltivati su piastre di HBA. Un fegato è stato raccolto da una infezione da Listeria C57BL / 6 del mouse a 3 giorni dopo l'infezione. Tessuto omogenato è stato preparato e diluizioni posto come 100 microlitri piatto pieno diffusione di diluizione per 10 -4 (A) e 10 -5 diluizione (B), così come 25 gocce microlitri su un piatto HBA per ogni diluizione 1:10 da non diluito al 10 -5 (C). Le piastre sono state incubate a 37 ° C durante la notte. Le diluizioni che consentono il conteggio delle singole colonie sono usati per determinare la carica batterica (cioè UFC / tessuto) a quel punto il tempo post-infezione.
Figura 3. Carico Listeria nella milza e nel fegato di topi infettati C57BL / 6 a 3 e 7 giorni dopo l'infezione. Topi C57BL / 6 sono stati infettati con ~ 2.000 CFU di Listeria. Ad ogni punto di tempo, i topi sono stati eutanasia, il fegato è stato perfuso e raccolte con la milza, e diluizioni dell'omogeneizzato splenica (A) o epatica cella singola sospensione (B) sono state coltivate in piastre di HBA per determinare la carica batterica. Le linee continue indicano media geometrica, e le barre verticali indicano SEM. La linea tratteggiata indica che il limite di rilevamento per la misurazione della carica batterica è di 100 UFC / organo per questo esperimento.
Figura 4. Conteggio delle cellule vitali per i tessuti di topi infetti. Topi C57BL / 6 sono stati infettati con ~ 2.000 CFU di Listeria. Ad ogni punto di tempo, i topi sono stati eutanasia, il fegato perfuso e raccolte con la milza. Le cellule sono state colorate con trypan blu e contati con un emocitometro come descritto al punto 5.9 (A). Leucociti Splenocyte (B) ed epatica (C) conta ottenute da singole cellule sospensioni preparate da Listeria topi infettati. Linee indicano media geometrica.
Figura 5. Analisi FACS di cellule T CD8 + in Listeria topi infettati. Topi C57BL / 6 sono stati infettati con ~ 2.000 CFU di Listeria. Ad ogni punto di tempo, i topi sono stati eutanasia, il fegato perfuso e raccolte con la milza. Cella singola sospensioni sono state colorate con anticorpi specifici per le cellule T (CD3, TCRβ, CD4, CD8). (A) Rappresentante profili FACS% con le cellule T CD8 + + / - SEM. (B) Totale cellule CD8 + T nella milza. (C) Totale cellule CD8 + T nel fegato.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare Anna Walduck, Christina Cheers, Stuart Berzins, Dale Godfrey, Yifan Zhan e Jonathan Wilksch per consigli e reagenti. Questo lavoro è stato finanziato dalla Juvenile Diabetes Research Foundation (1-2008-602) e la salute Australian National and Medical Research Council (575.552). NO è supportato da un premio post-laurea australiano. OW è supportato da una Wright RD Fellowship della Australian National Health Medical Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Horse blood agar base No.2 | Oxford Labware | CM0271 | Preparation of agar base for HBA plates |
| Horse blood (defibrinated) | Oxford Labware | HB1000 | Add 5-10% to agar base |
| Brain heart infusion (BHI) broth (10 mL) | Oxford Labware | TM456 | |
| Brain heart infusion dehydrated media | Oxford Labware | CM1135 | |
| 96-well flat bottom plate | BD Biosciences | 353072 | |
| 70 μm cell strainer | BD Biosciences | 352350 | |
| Small petri dish | BD Biosciences | 351007 | |
| Stomacher 80 biomaster lab system | Seward | ||
| Plastic Stomacher bags | Sarstedt Ltd | 86 9924 530 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A3912 | |
| FACS buffer | 0.1% (w/v) bovine serum albumin in PBS | ||
| Isotonic Percoll (33.75% Percoll in PBS) | GE Healthcare | 17-0891-01 | 33.75mL Percoll, 3.75mL 10x PBS, 62.5mL 1x PBS makes 100mL isotonic Percoll |
| TAC Buffer | 17mM Tris, 140mM ammonium chloride in distilled water | ||
| FCS/EDTA buffer | Fetal calf serum with 10mM EDTA | ||
| FACS/EDTA buffer | FACS buffer + 5mM EDTA | ||
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 | 0.4% (w/v) in PBS, filter sterilized |
| 2mL Cryovial | Greiner Bio-One | 121263 | |
| 27 gauge/1mL insulin syringe | Terumo Medical Corp. | SS10M2713 | |
| Needle | Terumo Medical Corp. | NN-2516R (25G 5/8in) NN-2613R (26G 1/2in) | |
| Syringe | Terumo Medical Corp. | SS-01T (1mL), SS-053 (5mL), SS-10S (10mL) |
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