Summary
Este protocolo descreve em particular o de extração de IgY totais de gema de ovo, por meio de precipitação polietileno glicol e dá informações gerais sobre a tecnologia IgY.
Abstract
Galinhas podem ser vacinadas, por meio de im vacinação (Musculus peitoral, esquerda e direita, o volume de injeção de 0,5-1,0 ml) ou por meio de Gene Gun-imunização plasmídeos. Dependente da imunogenicidade do antígeno, alto-anticorpo títulos (até 1:100.000 - 1:1.000.000) pode ser obtida após apenas uma ou 3-4 imunizações impulso. Normalmente, uma galinha põe ovos continuamente por cerca de 72 semanas, depois, a diminui a capacidade de postura. Este protocolo descreve a extração de IgY totais de gema de ovo, por meio de um processo de precipitação (PEG. Polson et al. 1980). O método envolve duas etapas importantes. O primeiro é a remoção de lipídios ea segunda é a precipitação de IgY totais do sobrenadante de um passo. Após diálise contra um buffer (normalmente PBS) o extrato de IgY-podem ser armazenadas a -20 ° C por mais de um ano. A pureza do extrato é de cerca de 80%, o total por IgY de ovos varia de 40-80 mg, dependendo da idade da galinha poedeira. Os aumentos IgY totais de conteúdo com a idade da galinha de cerca de 40 mg / ovo até 80 mg / ovo (PEG sobre precipitação). A capacidade de postura de uma galinha por ano é de cerca de 325 ovos. Isso significa que uma colheita total potencial de 20 g IgY total / ano, com base em um conteúdo IgY média de 60 mg total de ovos IgY / (ver Tabela 1).
Protocol
1. Protocolo - IgY-extração por meio de PEG-precipitação
Fig. 1 apresenta o esquema do processo de extração de IgY (ver Tabela 2). O protocolo foi descrita pela primeira vez em Polson et al. 1980.
Todas as etapas devem ser executadas usando luvas de látex.
- A casca é cuidadosamente rachada ea gema é transferido para uma "colher de gema", a fim de remover o ovo muito branco quanto possível.
- A gema é transferido para um papel de filtro e rolou para remover restantes clara de ovo, a gema, em seguida, a pele é cortada com uma lanceta ou um instrumento similar (pipeta ponta). A gema é colocada em um tubo de 50 ml eo volume de ovos está registrado (V1).
- Duas vezes o volume de gema de ovo PBS é misturado com o (ΣV1 + V2) gema, PEG 6000 depois de 3,5% (em grama, pulverizado) do volume total é adicionado e agitadas, seguido por 10 min que rola em um misturador de rolamento. Essa etapa do procedimento de extração separa a suspensão em duas fases. Uma fase consiste em "sólidos gema e substâncias gordas" (citação original de Polson et al. 1980) e uma fase aquosa contendo proteínas IgY e outros.
- Os tubos são centrifugados a 4 ° C por 20 min (10.000 rpm de acordo com a 13000 xg Heraeus Multifuge 3SR +, rotor ângulo fixo). O sobrenadante (V3) é filtrado através de um filtro dobrado e transferidos para um novo tubo.
- PEG 6000 8,5% em grama (calculado de acordo com o novo volume) são adicionados ao tubo, agitadas e rolou em um misturador evolutivo como no passo 3.
- Repita o passo 4 com a diferença que o sobrenadante é descartado.
- O pellet é cuidadosamente dissolvidos em 1 ml de PBS, por meio de um bastão de vidro eo vortexer. PBS é adicionado a um volume final de 10 ml (V4). A solução é misturada com PEG 6000 12% (w / v, 1,2 grama) e tratados como no passo 3 (vortex, rolando).
- Repita a etapa 6 e dissolver o sedimento cuidadosamente em 800 mL de PBS (vidro vara e vortex). Espere que as bolhas de ar para desaparecer e em seguida, transferir (pipeta) o extrato de uma cápsula de diálise. Lavar o tubo com 400 mL PBS e adicionar o volume para o dispositivo de diálise (V5). (Para a preparação de dispositivos de diálise e membranas ver anexo).
- O extrato é dialisada durante a noite em solução salina 0,1% (1.600 ml) e agitado suavemente por meio de um agitador magnético. Na manhã seguinte, a solução salina é substituído por PBS e dialisado por mais três horas.
- Posteriormente, o extrato de IgY é retirado da cápsula de diálise através de uma pipeta e transferidas para tubos de 2ml. O volume final é de cerca de 2 ml (V6).
- O teor de proteína (mg / mL) das amostras é medida por fotometria em 280 nm (1:50 diluído com PBS) e calculado de acordo com a lei de Lambert-Beer, com um coeficiente de extinção de 1,33 para IgY (ver fig. 2), Fig. . 4 mostra a qualidade da preparação (pureza e recuperação são cerca de 80%).
- É aconselhável para armazenar as amostras em alíquotas a -20 ° C (não congelar as amostras a -70 ° C).
- A qualidade dos preparativos finais é analisada por SDS-PAGE simples como descrito no protocolo JOVE http:/www.jove.com/details.php?id=1916
2. Apêndice-antes de usar o saco de diálise deve ser preparado da seguinte maneira de acordo com as recomendações do fabricante:
- 20 sacos de diálise são cortadas em pedaços de 30 cm e dado num copo de vidro 2000 ml.
- 1750 ml de 5 mM EDTA-solução são adicionados.
- Um funil de vidro é colocado acima dos sacos para garantir que os sacos são cobertos pela solução de EDTA. A solução é aquecida e fervida por 5 min (placa quente). A solução é decantado e os sacos são lavadas três vezes com água destilada.
- Mais uma vez 1750 ml EDTA-solução são adicionados, fervido por 5 min e lavadas três vezes com água destilada como acima.
- Finalmente os sacos de diálise são fervidos por 10 min em água destilada e armazenado a 4 ° C. Tirar os sacos de diálise por meio de pinças esterilizadas.
3. Resultados representativos
Figura 1. Diagrama esquemático de IgY-extração por meio de precipitação de polietileno glicol de acordo com a descrição original de Polson et al. 1980. Para ver uma imagem maior clique aqui.
Figura 2. Desenvolvimento do total-IgY na gema de ovo de galinhas imunizadas na dependência de idade. Dado é a média semanal do total IgY / ovo e SD (n = 4 galinhas poedeiras). A partir de [Pauly et al. 2009]).
Figura 3. Layimonitoramento capacidade ng de quatro galinhas imunizadas com diferentes antígenos. As setas indicam data de vacinação (de [Pauly et al. 2009]). Para ver uma imagem maior clique aqui.
Figura 4. Poliacrilamida Gelelectrophoresis de preparações individuais IgY de ovos diferentes sob condições redutoras
Pista 1 - marcador de peso molecular, Lane 2 - IgY-padrão, Lane 05/03 - IgY amostras diferentes preparado como descrito no protocolo. Estes são os últimos preparativos de acordo com o passo 10 do protocolo. HC - cadeias pesadas, LC - chaines luz,? - Impurezas menores correspondente ao peso molecular em torno de 35 kDa (provavelmente o fragmento C-terminal de vitelogenina precursor II, [Klimentzou et al, 2006.]).
| Chicken 21 (A Antigen) | Chicken 22 (um antígeno) | Chicken 19 (B Antigen) | Chicken 23 (C Antigen) | |
| Número de ovos (IgY total) 1, 2 anos-período | 625 (38 g) | 626 (38 g) | 545 (33 g) | 608 (37 g) |
| Número de ovos (IgY total), primeiro ano | 345 (20 g) | 304 (16 g) | 326 (18 g) | 308 (17 g) |
| Número de ovos (IgY total), segundo ano | 280 (18 g) | 322 (21 g) | 219 (15 g) | 300 (20 g) |
| % Do valor máximo. número de ovos possível (primeiro ano) 2 | 106 | 93 | 100 | 95 |
| % Do valor máximo. número de ovos possível (segundo ano) | 86 | 99 | 67 | 92 |
| número de ovos processados | 565 | 620 | 283 | 401 |
1 A quantidade de IgY total é calculado pela multiplicação do número de ovos por um valor médio de 60 mg de proteína por ovo de acordo com os dados da Figura 2.
O 2 max. número de ovos por ano é possível 325 de acordo com uma informação do criador.
Tabela 1. Estatísticas Dois anos de capacidade de postura de ovos de galinhas imunizadas com diferentes antígenos. Deitado capacidade em por cento do máximo de quatro galinhas após a imunização com antígenos diferentes, bem como o resultado IgY durante dois anos (ver também a fig. 3), [Pauly et al. 2009]).
| Nr ovo. | Nr galinha. Deitado Data | V1 [ml] yolk | V2 [ml] PBS | 1. PEG prec. [G] | Vol [ml] após | 2. PEG prec. [G] | Pastilha | 3. PEG prec. [G] | Pastilha | Vol [ml] | Proteínas totais mg / ml | Corrigida de proteína total mg / ml |
| 2xV1 ΣV1 + V2 | 3,5% [w / v] ΣV1 + V2 | prec., centrif. V3 e filtração | 8,5% [w / v] V3 | dissolvido em PBS ml V4 | 12% [w / v] V4 | Dissolvido em PBS ml V5 | Após diálise contra PBS V6 | A280/ml | A280/ml: 1,33 | |||
| 1 | H293 / 22,10. | 15 | 30 45 | 1,58 | 31 | 2,63 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 35,0 | 26,3 |
| 2 | H293 / 23h10. | 13 | 26 39 | 1,37 | 25 | 2,12 | 10 | 1,2 | 1,2 | 1,7 | 28,8 | 21,6 |
Tabela 2. Protocolo Exemplar de PEG precipitação
Discussion
A escolha de um método adequado de purificação de IgY é influenciado pela escala de purificação (laboratório ou industrial), a eficácia de custos, tecnologia (equipamentos de laboratório), eo impacto sobre o meio ambiente (gestão de resíduos). Vários métodos de extração IgY foram revistos em detalhe pelo De Meulenaer & Huyghebaert (2001, para revisão ver também Schade et al. 2005). Em geral, estes métodos podem ser divididos em três grupos principais:
- Métodos de precipitação: envolvendo amônio ou sulfato de sódio, polietilenoglicol (PEG), ácido caprílico e caragenean.
- Métodos cromatográficos: cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de interação thiophylic e gel-filtração cromatografia.
- Ultrafiltração.
A pureza de uma preparação IgY pode ser aumentada por uma combinação de métodos, por exemplo, PEG precipitação pode ser combinada com cromatografia de afinidade. Em alguns casos, dependendo da aplicação final, um extrato de água de IgY é suficiente para atingir bons resultados (Akita & Nakai 1993). De acordo com nossa experiência, a IgY-amostra obtemos por PEG-precipitação funcionou muito bem em um monte de diferentes ensaios imunológicos. Ao padronizar o método PEG-precipitação um assistente técnico é capaz de processar cerca de 84 ovos por semana, o que corresponde a uma quantidade de IgY total entre 4 e 7 g por semana. Um cálculo simples: uma galinha poedeira é imunizados com um antígeno. Depois de um impulso imunizações poucos a galinha produz anticorpos específicos (Ab) com um título de 1:50.000 durante um período de 30 dias. 30 ovos x 2 ml IgY extract (ver protocolo e fig. 3) corresponde a 60 ml IgY total, que por sua vez corresponde a uma diluição Ab-de 3.000 l (a capacidade de um balde é 10 l), isso significa que com 3.000 l de solução de Ab 300 baldes podem ser preenchidos. Assim, em vista de tal enorme quantidade Ab-it não é problema para armazenar um Ab-pool de qualidade constante e especificidade. Esta técnica reduz a variabilidade de carga / lote de outra forma observado em poliespecífico Ab.
Apesar do aspecto de quantidade, IgY Ab têm vantagens adicionais em comparação com IgG de mamíferos: Não ativação do sistema complemento em mamíferos, sem reatividade cruzada com HAMA (anticorpo anti rato humano), fatores reumatóide ou antígenos no sangue humano em grupo (falta de heteroagglutinins).
Uma vantagem notável de IgY-Ab é a distância filogenética so-called. Distância filogenética é a razão para as diferenças freqüentemente descritos entre as especificidades Ab de mamíferos e aves, mesmo quando idêntica imunizados. Além das diferenças entre os mamíferos e do sistema imunológico das aves si, diferenças de desenvolvimento filogenético nestas duas classes de animais contribui para as diferentes especificidades Ab. Vários autores têm relatado que as galinhas produzem frequentemente Abs contra filogeneticamente altamente conservada de proteínas de mamíferos ou peptídeos com mais eficiência do que os coelhos (para revisão ver Schade et a. 2005). Como conseqüência, um antígeno conservada pode permanecer "mascarados" para o sistema imunológico de coelho, e, portanto, causar apenas um fraco ou uma resposta "silenciosa". Além disso, se galinhas e coelhos são imunizados com o mesmo antígeno de mamíferos, muitas vezes os frangos respondem com uma especificidade Ab-que raramente pode ser alcançado em coelhos. Também o aspecto de bem-estar animal é importante, pois o Ab não-invasiva são extraídos de gema de ovo. Em combinação com Gene Gun-imunização (plasmídeo), o IgY-produção é totalmente não-invasiva (Witkowski et al. 2009).
Em conclusão, a produção de Ab em galinhas e as IgY-extração por meio de PEG-precipitação é muito custo-efetiva e resulta em Ab altamente específicas com títulos estáveis até 1:1.000.000. Devido à distância filogenética entre Aves e Mamíferos, frango são capazes de produzir Ab específica contra antígenos altamente conservada em mamíferos, em contraste com os coelhos, por exemplo. A extraordinária quantidade de Ab IgY obtidos por tecnologia abre as portas também para a utilização de IgY-Ab na medicina humana e veterinária para fins terapêuticos / profilático.
Disclosures
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pelo pêlo Landesamt Gesundheit und Soziales Berlin (H 0069/03).
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado por uma doação do Ministério Federal Alemão de Educação e Pesquisa (Projeto BiGRUDI [Bi ologische G efahrenlagen: R isikobewertung, u ltraschnelle D etektion und eu dentifizierung von bioterroristisch relevanten Agenzien, 13N9594]). Agradecemos a B. Diemar (Charité-Universitätsmedizin Berlim, Institut für Pharmakologie) para assistência técnica excelente.
Materials
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References
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