Summary
Abstract
רוב מקרי המוות ממלריה האדם נגרמות על ידי דם בשלב טפילים Plasmodium falciparum. מלריה מוחין, הסיבוך ביותר סכנת חיים של המחלה, מאופיין על ידי הצטברות של תאים נגועים Plasmodium falciparum הדם האדומים (iRBC) בשלב trophozoite פיגמנט ב microvasculature של המוח 2-4. זו חסימה microvessel (קיבוע) מוביל היפוקסיה חמצת ו ציטוקינים דלקתיים מזיקים (הנסקרת ב 5). תפיסת נמצא גם ברקמות כלי הדם ביותר של גוף האדם 2, 3. המנגנון שבאמצעותו iRBC לצרף את דפנות כלי הדם הוא עדיין ממעטים להבין.
המוח הנציח האדם כלי הדם האנדותל Cell קו (HBEC-5i) שימש מודל במבחנה של מחסום דם מוח 6. עם זאת, Plasmodium falciparum iRBC לצרף רק גרוע HBEC-5i במבחנה, בניגוד sequestrat צפוףיון המתרחשת במקרים קדחת המוח. לפיכך, אנו פיתחו assay פנורמי לבחור (להעשיר) פ שונים falciparum זנים של הידבקות HBEC-5i על מנת לקבל אוכלוסיות גבוהה מחייב טפילים, נציג נוסף של המתרחש in vivo.
מדגם של תרבות טפיל (תערובת של RBC ו iRBC נגוע) בשלב trophozoite פיגמנט הוא שטף מודגרות על שכבה של HBEC-5i גדל על צלחת פטרי. לאחר דגירה, המנה נשטף בעדינות ללא uRBC ו iRBC מאוגד. URBC טרי מתווספים iRBC המעטים המצורפת HBEC-5i ו מודגרות לילה. כמו טפילים בשלב schizont פרץ, merozoites לפלוש RBC אלה בשלב טפילים טבעת נקצרים למחרת. טפילים הם בתרבית עד מתקבל מספיק חומר (בדרך כלל 2 עד 4 שבועות) ו סבב חדש של בחירה יכול להתבצע. בהתאם P. falciparum זן, 4-7 סיבובים של מבחר נדרשים כדי לקבל אוכלוסיהאיפה הכי טפילים להיקשר HBEC-5i. פנוטיפ הכריכה הוא איבד בהדרגה לאחר כמה שבועות, מה שמעיד על מתג במשטח ביטוי גרסה אנטיגן הגן, ובכך מבחר קבוע HBEC-5i נדרש כדי לשמור על הפנוטיפ.
לסיכום, פיתחנו טיוח assay הבחירה פ טפילים falciparum יותר "קדחת המוח דבק" פנוטיפ. היינו יכולים לבחור 3 מתוך 4 פ falciparum זנים על HBEC-5i. Assay זה גם בהצלחה שימשו כדי לבחור טפילים עבור מחייב אנושי לתאי אנדותל עורי ואת ריאתי. חשוב לציין כי בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבחור רקמה ספציפית אוכלוסיות הטפיל על מנת לזהות טפיל ligands מועמד מחייב האנדותל במוח. יתר על כן, assay זה יכול לשמש עבור מסך נגד התפיסה תרופות המשוערת 7.
Protocol
המלצות כלליות
אנדותל כלי הדם במוח האדם תאים (HBEC-5i) תרבות תוארה בעבר 6, 8. פ טפילים falciparum היו מתורבתים כמו 9. שני HBEC-5i ו פ falciparum תרבויות טפיל צריך להישמר בתנאים סטריליים בכל עת. ריאגנטים כל צריך להיות מחומם מראש על 37 ° C. אנו ממליצים לבדוק באופן קבוע עבור זיהום mycoplasma 10 על ידי ה-PCR (Minevera Biolabs, הוראות היצרן הבא). הפרוטוקול הוא סיכם באיור 1.
1. תא האנדותל שגרתי תרבות
- הכן את ריאגנטים הצורך.
| בינוני להכין | ריאגנטים | כמות |
| "שלם DMEM" | DMEM-F12 חם | 500ml |
| | L-גלוטמין 200mm | 5 מ"ל |
| פניצילין / סטרפטומיצין 100x | 5 מ"ל | |
| NaOH 1M | 1.3 מ"ל (כדי להתאים את ה-pH 7.4) | |
| "להשלים DMEM" | "שלם DMEM" | 450ml |
| Foetal שור סרום חום מומת | 50 מ"ל | |
| תא האנדותל צמיחה תוספת | 5 מ"ל |
- תרבות HBEC-5i בבקבוק 25cm 2 עם פרקו בינוני DMEM 10ml להשלים 37 ° C חממה עם 5% CO 2.
- המעבר התאים כאשר הם הופכים ומחוברות. הסר את המדיום הישן על ידי יניקה ולשטוף פעמיים באמצעות מדיום DMEM שלם או בתרבית רקמה כיתה PBS (Ca 2 + ו - Mg 2 + החופשי) מראש לחמם 37 ° C.
- הוסף 1ml של נסה טרום חימםpsin-EDTA (0.025% טריפסין, 0.5mm EDTA), מערבולת לכסות את מכלול הבקבוק ואת דגירה דקות ~ 2 ב 37 ° C.
- בדוק תחת מיקרוסקופ הפוכה, כי לפחות 90% של תאים היו מנותקים. אם יש צורך, לדפוק בעדינות את החלק התחתון של הבקבוק כדי לסלק תאים חסיד. הוסף 10 מ"ל של מדיום DMEM להשלים לחסום את התאים טריפסין ולהעביר לתוך צינור חרוטי 15 מ"ל. צנטריפוגה דקות 4 ב 300 גרם בטמפרטורת החדר (RT).
- בטל supernatant ו resuspend גלולה עם 10 מ"ל של מדיום DMEM להשלים. פיפטה הפתרון מעלה ומטה כדי ביסודיות resuspend התאים.
- הוסף 1 או 2 מ"ל של השעיה התא לתוך בקבוק תרבות חדשה ולהוסיף 8ml של מדיום חדש כדי לשמור על תרבות. הערכת הצמיחה תרבות מדי יום תחת מיקרוסקופ הפוכה ולשנות בינוני כל 2 או 3 ימים לפני שהוא הופך צהוב.
2. הכנת לתאי אנדותל למבחר
- יומיים לפני יום של selectio n, להוסיף פיברונקטין מדולל סטרילי PBS (2 מיקרוגרם / cm 2) באחד (או יותר) 60 צלחת פטרי מ"מ. דגירה את המנה דקות 5-20 ב 37 ° C, ולאחר מכן להסיר את הפתרון פיברונקטין, אשר ניתן לאחסן 4 ° C למשך חודש מחדש בשימוש פעם אחת.
- תאים מעבר כמתואר בסעיפים 1.3. עד 1.5. בהנחה תאים ומחוברות 100% היו מנותקים resuspended במדיום DMEM 10ml מלאה (סעיף 1.6., Resuspend עם נפח שווה ערך של המדיום confluency אם הוא נמוך יותר, למשל עם resuspend 8ml אם confluency היה 80%), להוסיף 1.5ml של מושעה התאים את צלחת פטרי פיברונקטין מצופה ועוד 1.5ml של המדיום DMEM להשלים.
- מניחים את צלחת פטרי seeded בחממה. הערה: באופן אידיאלי, confluency יהיה סביב 90% בעת בחירת כעבור יומיים.
- אופציונלי. כדי להפעיל HBEC-5i, מוסיפים את ציטוקינים (נמק פקטור Tumour) TNF בריכוז סופי של 24 שעות 50μg/ml לפני הבחירה.
- הכנת חומרים כימיים הדרושים (ראה טבלה כאן מתחת). הכן אנושי בתאי דם אדומים (RBC) על ידי הפרדת דם מלא (קבוצת O +) על ידי מעבר דרך מסנן דלדול לויקוציטים (ראה "שיטות מחקר מלריה" פרסום 11 עבור culturing מלריה טפילים כללי). לשטוף RBC פעמיים centrifuging ב 400 גרם דקות 5 ו resuspending אותם עם 10 מ"ל RPMI שלם. שמור RBC שטף ב 4 ° C בינוני שלם על המטוקריט של 50%.
| בינוני להכין | ריאגנטים | כמות |
| "שלם RPMI" | RPMI 1640 (עם סודה) | 500ml |
| Hepes 1M | 12.5ml | |
| גלוקוז 20% | 5 מ"ל | |
| L-גלוטמין 200mm | 5 מ"ל | |
| Gentamycin 50mg/ml | 250μl | |
| NaOH 1M | 0.7 מ"ל (כדי להתאים את ה-pH 7.2) | |
| "RPMI שלם" | "שלם RPMI" | 450ml |
| משולב האנושי (הלא החיסונית) בסרום | 50 מ"ל |
- תרבות פ falciparum נגוע RBC בינוני RPMI להשלים עם המטוקריט ב 2% ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס עם 3% CO 2, 1% O 2, ו - 96% N 2. הפוך את כתם Giemsa 11 יום על מנת להעריך את שלב ההתפתחות של טפילים (איור 2).
- באופן קבוע (בערך פעם בשבוע) לסנכרן את התרבות על ידי טיפול סורביטול 12. יום לפני בחירת השמאי, לשאוף לתרבות טבעת שלב ב parasitaemia 5% או יותר (רצוי לפחות 10%).
4. מבחר פ falciparum עבור cytoadhesion לתאי אנדותל
- ביום של assay, התרבות הטפיל צריכים להיות בשלב trophozoite פיגמנט (איור 2) (אידיאלי parasitaemia 10%) בעוד HBEC-5i תרבות צריך להיות% 50-100 confluency (רצוי 90%). נפח תא 30μl ארוז התרבות הטפיל יש צורך לכל צלחת פטרי HBEC-5i.
- לשטוף פעמיים על ידי טפילים centrifuging (500 גרם דקות 5) 1.5ml של התרבות הטפיל. בטל supernatant ו resuspend עם 10 מ"ל של טריים, בינוני חימם DMEM, שלם. חזור על לשטוף פעם שנייה. Resuspend נפח תא 30μl ארוז עם 1.5ml של DMEM שלם עם BSA 1%.
- שטפו את HBEC-5i מצופה צלחת פטרי פעמיים aspirating בינוני והוספת 3ml של DMEM שלם.
- מוסיפים את הפתרון של טפילים לצלחת HBEC-5i ו לדגור על 37 ° C עבור 75min. Resuspend טפילים פעמיים (אחרי 30 ו - 60 דקות) בזמן הדגירהעל ידי מנענעת בעדינות את המנה בתוך ארבעת הכיוונים, כמו גם עם כיוון השעון ונגד כיוון השעון.
- לאחר דגירה, לשטוף את המנה 5 פעמים על ידי aspirating בינוני, באמצעות פיפטה פסטר מפלסטיק להוסיף 3 מ"ל של מדיום DMEM חם שלם, נדנדה עדין. אם מאכלים רבים נמצאים בשימוש, לשמור אותם על משטח חם, כמו בקבוק גדול מלא במים ב 37 ° C.
- בדוק את צלחת תחת מיקרוסקופ הפוכה. אם RBC נגוע רבים עדיין לעין, לעשות שוטף יותר כפי שתואר לעיל. טפל צלחת פטרי בזהירות רבה כדי למנוע סיכון של זיהום.
- הסר בינוני מצלחת ולהוסיף 3ml של המדיום RPMI חם להשלים עם נפח תא 40μl ארוז של uRBC טריים.
- מניחים את צלחת בחדר אטום דוגרים, גז זה 3 דקות והמקום קאמרית באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
- למחרת, הקציר טפילים על ידי שטיפה עם המדיום RPMI שלם, באופן דומה, כמתואר בסעיף 4.4. אך ביתר שאת. Keep בינוני כל שימוש (המכיל resuspended RBC) בצינור חרוטי 15 מ"ל. בדוק תחת מיקרוסקופ הפוכה שכל RBC הוסרו מן המנה.
- גלולה הטפילים, להשליך את supernatant, resuspend במדיום RPMI 5 מ"ל מקום להשלים את התערובת בבקבוק עבור culturing נורמלי.
5. נציג תוצאות
טפילים שלא נבחר להראות רמה נמוכה של כבילת HBEC-5i (איור 3A). לפיכך, לאחר הסיבוב הראשון של הבחירה, טפילים מעט מאוד יהיה לקצור וזה עשוי להימשך עד חודש של culturing להגיע parasitaemia מספיק בסיבוב השני של הבחירה. אחרי כל סיבוב הבחירה, טפילים יותר ויותר להיקשר לתאי האנדותל את הבחירות ניתן לחזור במרווחי זמן קצרים יותר. אחרי 4-5 סיבובים של בחירה גבוהה מחייב אוכלוסיות הטפיל מתקבלים (איור 3).
בידיים שלנו, את הכריכה של HB3-HBEC כדי HBEC-5i או TNF מופעל HBEC-5i היה של הסיםרמת ilar (מידע לא מוצג).
הפרוטוקול המתואר כאן נבחנה עם 4 פ ' falciparum זנים: HB3, IT/FCR3, 3D7 ו Dd2 (טבלה 1). רק שהאחרון לא הוכיח מסוגל להיקשר HBEC-5i, אפילו לאחר 5 סיבובי בחירה.
HB3 טפילים נבחרו גם cytoadherence כדי Dermal ו ריאתי תאים אנושיים אנדותל כלי הדם (HDMEC ו HPMEC). לאחר 4 סיבובים של בחירה, תוך שימוש בשיטה המתוארת כאן, אוכלוסייה גבוהה מחייב הושג משני HDMEC ו HPMEC (איור 4).
באיור 1. סקירה כללית של תהליך הבחירה.
2. איור פיתוח בשלבים של פ falciparum נגועים בתאי דם אדומים. למרוח Giemsa דמיינו במיקרוסקופ בהגדלה 1000x.
באיור 3. דוגמה אופיינית של טפילים מחייב HBEC-5i. (א) שכבת כחול HBEC-5i קבוע עם glutaraldehyde ומוכתמת עם Giemsa, דמיינו במיקרוסקופ בהגדלה 1000x. התמונות צולמו לאחר uRBC ו iRBC מאוגד נשטפו. הלוח השמאלי מציג פ 'יחיד falciparum HB3 (שלא נבחר) טפיל בהכרח HBEC-5i. בלוח הימני HB3-HBEC הטפילים נבחרו 5 סיבובים. (ב) נתונים מייצג את הממוצע של שני ניסויים בלתי תלויים, כל שבוצעו כפולים. מספר טפילים מחויב לכל תא האנדותל נמנה.
טבלה 1. סיכום של זנים Plasmodium falciparum כי נבחרו בהצלחה מחייב הערה. HBEC-5i כי HB3 נבחר גם על TNF-הופעל HBEC-5i. לאחר 5 סיבובי בחירה, את המתח Dd2 לא הראו עלייה מחייב HBEC-5i לעומת נבחר-Dd2.
איור 4. עקידת פ falciparum HB3 טפילים עד (HPMEC) תאים עורי (HDMEC) ו ריאתי אנדותל, לפני ואחרי 4 סיבובים של הבחירה. למרות בינוני תרבות HDMEC ו HPMEC מעט שונה (ראה הוראות של הספק), את פרוטוקול המשמש הבחירה היתה זהה כמו HBEC-5i. תמונות שצולמו בהגדלה של 400X.
| שם מגיב | חברה | מספר קטלוגי | תגובות |
| DMEM-F12 חם | סיגמא | D6421 | במשך בינוני DMEM להשלים |
| L-גלוטמין 200mm | GIBCO | 25030 | במשך בינוני DMEM ו RPMI להשלים |
| פניצילין / סטרפטומיצין 100x (10,000 יחידות / מ"ל ו 10mg/ml) | ScienCell | 0503 | במשך בינוני DMEM להשלים |
| Foetal שור סרום חום מומת | ScienCell | 0025 | במשך בינוני DMEM להשלים |
| טריפסין-EDTA (0.025% טריפסין, 0.5mm EDTA) | ScienCell | 0103 | |
| תא האנדותל צמיחה תוספת | ScienCell | 1052 | במשך בינוני DMEM להשלים |
| תרבות רקמות טופלו 60 מ"מ X 15 מ"מ צלחות פטרי | BD | 353002 | |
| האדם פיברונקטין | Millipore | FC010 | השתמש ב מיקרוגרם 2 / 2 ס"מ |
| TNF | מו"פד מערכות | 210-TA | אופציונלי, יש להשתמש ב 50 מיקרוגרם / מ"ל |
| RPMI 1640 | Lonza | BE12-167F | במשך בינוני RPMI להשלים |
| Gentamycin 50mg/ml | Lonza | 17-518Z | במשך בינוני RPMI להשלים |
| Hepes 1M | Lonza | BE17-737E | במשך בינוני RPMI להשלים |
| HDMEC | ScienCell | 2000 | תא ראשי קו |
| HPMEC | ScienCell | 3000 | תא ראשי קו |
| HBEC-5i | המתקבל פרנסיסקו Candal (fcandal@cdc.gov) |
טבלה 2. חומרים
Discussion
סימן ההיכר של קדחת המוח הוא התפיסה של פ falciparum iRBC בתוך המוח microvasculature 2, 3. עם זאת, בתרבויות חוץ גופית של פ falciparum רק cytoadhere גרוע HBEC-5i, מודל האנדותל המוח האנושי כלי הדם. כאן פיתחנו assay פשוט להעשיר את האוכלוסייה מחייב HBEC-5i, יותר "כמו ב-vivo" פנוטיפ. שלושה מתוך 4 פ זנים falciparum נבחרו בהצלחה בשיטה זו. יתר על כן, HB3 נבחר גם על HDMEC ו HPMEC, המעיד על כך פרוטוקול יכול לשמש טפיל שונים וסוגי תא האנדותל.
השערות שונות עשויות להסביר את חוסר מחייב עם המתח Dd2. הסיכוי הטוב ביותר להיות העובדה כי קו זה הוא טפיל knobless, אשר עמוק מונעת את cytoadherence 13, 14.
אנו ממליצים טפילים culturing נבחר לצד הפרו את הבחירהCess לספק הביקורת. הדבר יאפשר, למשל, להשוות את transcriptome של טפילים מחייב ולא מחייב, בתקווה לגלות מועמדים ליגנד טפיל.
TNF היא ציטוקינים נמצא ברמה גבוהה אצל חולי מלריה מוחית כבר להראות לעורר את הביטוי של חלבונים רבים של פני השטח HBEC-5i (Claessens ואח', כהכנה ו 8, 15, 16). במקרה זה, את כמות iRBC מחויב היה דומה נורמלי HBEC-5i לעומת מופעל HBEC-5i.
"מודל התפיסה" זה יכול לשמש גם כדי ללמוד את האינטראקציה המולקולרית בין iRBC ואת תא האנדותל, כמו גם את ההשפעה של תרופות אנטי cytoadherence המשוערת. במקרה זה, אנו ממליצים ציפוי HBEC-5i בבארות קטנים יותר, כגון "8-קאמרית גם שקופיות" (BD 354,628) או "CultureWell" (Sigma-C7735 20EA).
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
אנו מודים פרנסיסקו Candal, ה-CDC העברת טכנולוגיה Office, אטלנטה ג'ורג'יה עבור HBEC-5i תאים. עבודה זו מומנה על ידי קרן Wellcome (4 בשנה מלגת הלימודים לתואר שלישי ל-AC ו - מלגה בכיר במדעי ביו בסיסי JAR, מענק מספר 084226).
References
- Scherf, A. Antigenic variation in malaria: in situ switching, relaxed and mutually exclusive transcription of var genes during intra-erythrocytic development in Plasmodium falciparum. Embo. J. 17, 5418-5426 (1998).
- MacPherson, G. G., Warrell, M. J., White, N. J., Looareesuwan, S., Warrell, D. A. Human cerebral malaria. A quantitative ultrastructural analysis of parasitized erythrocyte sequestration. Am. J. Pathol. 119, 385-401 (1985).
- Seydel, K. B., Milner, D. A., Kamiza, S. B., Molyneux, M. E., Taylor, T. E. The distribution and intensity of parasite sequestration in comatose Malawian children. J. Infect. Dis. 194, 208-208 (2006).
- Taylor, T. E. Differentiating the pathologies of cerebral malaria by postmortem parasite counts. Nat. Med. 10, 143-145 (2004).
- van der Heyde, H. C., Nolan, J., Combes, V., Gramaglia, I., Grau, G. E. A unified hypothesis for the genesis of cerebral malaria: sequestration, inflammation and hemostasis leading to microcirculatory dysfunction. Trends. Parasitol. 22, 503-508 (2006).
- Dorovini-Zis, K., Prameya, R., Bowman, P. D. Culture and characterization of microvascular endothelial cells derived from human brain. Lab. Invest. 64, 425-436 (1991).
- Rowe, J. A., Claessens, A., Corrigan, R. A., Arman, M. Adhesion of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes to human cells: molecular mechanisms and therapeutic implications. Expert reviews in molecular medicine. 11, e16-e16 (2009).
- Xiao, L. Plasmodium falciparum: involvement of additional receptors in the cytoadherence of infected erythrocytes to microvascular endothelial cells. Exp. Parasitol. 84, 42-55 (1996).
- Corrigan, R. A., Rowe, J. A. Strain variation in early innate cytokine induction by Plasmodium falciparum. Parasite. Immunol. 32, 512-527 (2010).
- Rowe, J. A. Implications of mycoplasma contamination in Plasmodium falciparum cultures and methods for its detection and eradication. Mol. Biochem. Parasitol. 92, 177-180 (1998).
- Moll, K., Ljungström, I., Perlmann, H., Scherf, A., Wahlgren, M. Methods in Malaria Research. , MR4/ATCC. (2009).
- Lambros, C., Vanderberg, J. P. Synchronization of Plasmodium falciparum erythrocytic stages in culture. J. Parasitol. 65, 418-420 (1979).
- Herricks, T., Antia, M., Rathod, P. K. Deformability limits of Plasmodium falciparum-infected red blood cells. Cell. Microbiol. , (2009).
- Nakamura, K., Hasler, T., Morehead, K., Howard, R. J., Aikawa, M. Plasmodium falciparum-infected erythrocyte receptor(s) for CD36 and thrombospondin are restricted to knobs on the erythrocyte surface. J. Histochem. Cytochem. 40, 1419-1422 (1992).
- Wassmer, S. C., Cianciolo, G. J., Combes, V., Grau, G. E. LMP-420, a new therapeutic approach for cerebral malaria. Med. Sci. (Paris). 22, 343-345 (2006).
- Wassmer, S. C., Combes, V., Candal, F. J., Juhan-Vague, I., Grau, G. E. Platelets potentiate brain endothelial alterations induced by Plasmodium falciparum. Infect. Immun. 74, 645-653 (2006).
