Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis Diktiyostelyum diskodeyum Published: September 20, 2011 doi: 10.3791/3128
Automatic Translation
1, 1
1Chemotaxis Signal Section, Laboratory of Immunogenetics, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health

Summary

Burada, kemotaksis soruşturma için ayrıntılı canlı hücre görüntüleme yöntemleri açıklanmaktadır. Biz göç eden hücreleri olayları sinyal Spatiotemporal dinamiklerini izlemek için floresan mikroskobik yöntemler sunuyoruz. Ölçüm sinyal olayların bir GPCR sinyal ağı daha chemoattractants ve kontroller ökaryotik hücrelerin yönlü göç algılama degrade nasıl elde ettiğini anlamak için bize izin verir.

Abstract

Birçok ökaryotik hücrelerin kendi ortamlarında kimyasal sinyallerin degradeler algılar ve buna göre 1 geçirebilirsiniz. Bu güdümlü hücre göçü, bağışıklık hücreleri ve nöronal hücrelerin 2, 3 desenlendirme ticareti gibi görevleri yürütmek için çeşitli hücreler için gerekli kemotaksis olarak adlandırılır . G-protein reseptörler büyük bir aile (GPCRs), in vivo 4, kemokinler olarak bilinen değişken küçük peptidler, hücre göçü doğrudan algılar . Kemotaksis araştırma nihai hedefi, bir GPCR makine duyuları kemokin Degradeleri ve kontrolleri kemotaksis için önde gelen olaylar sinyalizasyon nasıl anlamak için. Bu amaçla, biz kemoatraktan bir degrade chemoattractants, hücre hareketi uzaysal konsantrasyonlarını izlemek için gerçek zamanlı olarak görüntüleme teknikleri kullanmak, GPCR heterotrimeric G-protein aktivasyonu aracılı ve 5-8 ökaryotik hücrelerin kemotaksis alan hücre içi sinyal olaylar . Basit ökaryot organizma, Diktiyostelyum diskodeyum, lökositlerin benzer chemotaxic davranışlar gösterir, ve D. diskodeyum ökaryotik kemotaksis eğitim için önemli bir model sistem. Serbest yaşayan amipler, D. olarak diskodeyum hücrelerin zengin orta bölün. Açlıktan sonra, hücreler multicullular yapıları oluşturmak cAMP aracılı kemotaksis aracılığıyla toplu bir gelişim programına girmek. D. cAMP kemotaksis dahil birçok bileşenleri tespit edilmiştir diskodeyum. Bir GPCR cAMP bağlama (car1) Gγ ve Gβγ altbirimden 7, 9, 10 Fototerapisi heterotrimeric G-proteinleri neden olur. Gβγ altbirimden sırayla aktive PI3K 3 PIP PIP 2 hücre zarının 11-13 dönüştürme Ras etkinleştirin. PIP 3, böylece bu proteinlerin membran 14, 15 işe pleckstrin Homoloji (PH) etki ile proteinler için bağlanma yerleri olarak hizmet vermektedir . Car1 reseptörlerinin aktivasyonu 3 PIP PIP 2 16, 17 dephosphorylates PTEN, membran dernekler de kontrol eder. Moleküler mekanizmaları, evrimsel olarak nötrofil 18 gibi insan hücrelerinin kemokin GPCR aracılı kemotaksis korunmuş . D. kemotaksis çalışmak için aşağıdaki yöntemlerden mevcut diskodeyum hücreleri. 1. Kemotaktik bileşeni hücrelerinin hazırlanması. 2. CAMP degrade hücre Görüntüleme kemotaksis. 3. , G-protein heterotrimeric tek canlı hücreler bir GPCR kaynaklı aktivasyon izleme. 4. Görüntüleme kemoatraktan tetiklenen dinamik PIP 3, gerçek zamanlı olarak tek canlı hücrelerinde yanıtlar . Bizim gelişmiş görüntüleme yöntemleri, insan lökositlerin kemotaksis çalışma yapılabilir.

Protocol

1. Diktiyostelyum diskodeyum kemotaktik yetkili hücrelerinin hazırlanması

  1. Kemoatraktan cAMP, 22 sallayarak kültürünün zengin medya D3-T hasat büyüyen hücreleri ° C kemotaktik D. diskodeyum hücreleri oluşturmak için
  2. (DB tampon 5 mM Na 2 HPO 4, 5 mM KH 2 PO 4, 2 mM MgCl 2, ve 0,1 mM CaCl 2 içeren), besin değeri olmayan gelişim tampon hücreler iki kez yıkayın.
  3. 2x10 7 hücre / ml yoğunlukta DB tampon hücreleri yeniden askıya.
  4. Bir saat için 100 rpm at 22 ° C 10 ml, 250 ml cam şişe içinde hücreleri iyice çalkalayın.
  5. 75 nM cAMP, cAMP darbeli tedavi olarak belirlenmiş bir süreç nihai bir konsantrasyon elde etmek için 6 saat boyunca her altı dakikada bir 10 ml hücre 7.5 mcM cAMP stokunun 100 ul sunun. CAMP pulsing tedavi, D. 5-6 saat sonra diskodeyum hücreleri cAMP degrade doğru yetkili kemotaktik olur.
  6. 5 dakika için 200 g santrifüj hücreleri toplamak ve sonra DB tamponu ile tekrar süspansiyon hücreleri 2.5 mM kafein içeren ve 200 rpm'de 22 sallamak ° C'de 20 dakika için kemotaktik bir durum hücre basolate için.

2. Görünür ve manipüle kemoatraktan degrade Görüntüleme chemotaxing hücreleri

  1. Dolgu 1 mcM cAMP ve Alexa 594 DB tampon 0.1μg/μl az bir taze hazırlanmış 30 ul çözüm mikropipet.
  2. Mikropipet sahibine Femtotip takın ve bir basınç kaynağı aparatları boru, Eppendorf FemtoJet sistemi bağlamak.
  3. Istikrarlı bir degrade oluşturmak amacıyla sabit bir basınç sağlamak için mikromanipülatör motorlu bir micromanipulator (Eppendorf TransferMan NK2) mikropipet montaj takın.
  4. Mount konfokal mikroskop 40X petrol lensin üzerinden 6 ml DB tampon ile dolu bir iyi LABTEK odasına ve görüş alanı içine alan parlak optik, merkezi Femtotip kullanın.
  5. Basınç kaynağı açın ve cAMP / Alexa 594 karışımı bir degrade oluşturmak için 70 hPa tazminat basıncı (Adet).
  6. CAMP ve Alexa 594 floresan 543 nm lazer çizgisi ile uyarma kullanarak istenilen konsantrasyon karışımı izlenmesi cAMP degrade gözünüzde canlandırın.
  7. Mikromanipülatör otomatik konumlama işlevi istenilen pozisyonlar mikropipet koymak ve Pozisyonu 1 Pozisyon 2 ve 3 numaralı pozisyon için hücre maruz kaldığı degrade işlemek için onları ayarlamak için kullanın.

3. TAŞINMAZ nonpolarized hücre sistemi cAMP degrade algılama dahil görüntüleme sinyalleme olaylarını kolaylaştırır

  1. Kafein tedavi 500g az 3 dakika sonra, bir kısım hücreler ve santrifüj çıkarın.
  2. Tamponu çıkarın ve 2.5 mM kafein içeren taze DB tamponu ile 5x10 5 hücre / ml hücreleri sulandırmak.
  3. Iyi dört odanın her bir kuyu için bir tek iyi oda veya 0.4 ml 1 ml hücre süspansiyonu uygulayın.
  4. 10 dakika için, dikkatlice unattached hücreleri çıkarmak ve aynı hacmi ile yerine tampon pipetle hücreleri uyması izin verin.
  5. Istenilen hücrelerin mikroskop altında bulun ve görüntüleme başlayın.
  6. Istikrarlı bir degrade açığa hücreleri bileşenleri sinyal dinamiklerini izlemek için tasarlanmış bir deney için, deneyler öncesinde 10 dakika süreyle 5.0 mcM (son konsantrasyon) Latrunculin B hücreleri tedavi.

4. Eşzamanlı izleme heterotrimeric G-protein aktivasyonu ve PIP 3 üretim

  1. cAMP hücreleri ortak ifade GαCFP ve YFPGβ (G hücreleri) ve hücreleri PIP 3 gösterge PH-GFP (PH hücreleri) 7 ifade geliştirmek darbeli
  2. 1:1 oranında ve plaka bunları tek-iyi ya da 4-kuyu odaları ile bu iki tip hücre karıştırın.
  3. Oluşturun ve 10 nm genişliği ile 464 ila 624 nm spektral aralığında Lambda Yığın Acquisition modunu kullanarak emisyon parmak izi referans eğrisi CFP, YFP ve GFP kaydetmek.
  4. G hücreleri ve PIP 3 üretim, 464, 10 nm artışlarla ile 544 nm spektral aralığında aynı Lambda Yığın Toplama modu ile PH hücrelerde aynı anda görüntü G-protein aktivasyonu.
  5. G. bireysel kanal içine CFP ve YFP yoğunluğu ayrı matematiksel Lambda Yığın her fluorofor katkısını hesaplamak için kaydedilmiş CFPand YFP ve emisyon parmak izlerini kullanarak Zeiss 510META yazılımı Lineer Karışmama işlevi uygular
  6. Aynı strateji ile, matematiksel olarak PH hücreler, GFP yoğunluğunu hesaplamak için kaydedilmiş GFP ve arka plan emisyon parmak izlerini kullanarak doğrusal Karışmama fonksiyonu geçerlidir.

5. Temsilcisi sonuçları:

  1. D. mükemmel bir model sistem sosyal bir amip, D. GPCR aracılı kemotaksis diskodeyum. diskodeyum yaşam döngüsü sırasında çarpıcı bir kemotaksis sergiler. Genetik ve biyokimyasal avantajları nedeniyle, D. d güçlü bir sistem kemotaksis çalışma.
  2. Görünür ve manipüle chemoattract alanları altında hücreler, Kemotaksis Burada, biz ilk olarak 10 mg / ml ile karıştırılarak 2 mcM cAMP seyreltme dizi cAMP konsantrasyonu ve floresan boya Alexa 594 yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki elde etmek için basit bir yöntem gösterir Alexa 594 (Şekil 2A). Sonra, Alexa 594 (Şekil Şekil 2B) yoğunluğunu bir degrade cAMP konsantrasyonunun kantitatif bir ölçüm kurmak, dahası, degrade görselleştirmek için kolay bir yol sağlar.
  3. Hücre hareketi, hücre kutuplaşma ve yön algılama Kuplajsız aktin polimerizasyonu inhibitörü önceden mevcut morfolojik polarite ortadan kaldırır ve hücrelerin yönlü algılama yeteneği (Şekil 3A) korurken aynı zamanda hücre hareketi önler. Örneğin düzgün uygulanan uyarılar veya bir degrade görünür ve manipüle cAMP stimülasyonu İstihdam, giriş garanti eder. Bu yöntem, kantitatif analiz degrade algılama makine anahtar sinyal bileşenlerinin cAMP bağlı yeniden dağıtımı sağlar. Bu sinyal bileşenlerinin Ölçülen Spatiotemporal dinamikleri gradyanlar (Şekil 3B) polarize biyokimyasal tepkileri üretirken sinyalizasyon ağı tek tip uyarılara uyum nasıl elde ettiğini anlamak için izin verir.
  4. Istikrarlı bir degrade maruz üzerine sinyalizasyon ağı chemosensing kinetiği Sistemik ölçüm yön-algılama hücreleri ilk degrade karşılaştığınızda, her bir bileşenin hücre içi kutuplaşma kurulmasına nasıl katkıda bileşenleri anlamak için sinyalizasyon dinamikleri / kinetik ölçmek için çok önemlidir. Yüksek bir tempo-uzaysal çözünürlüğü ile canlı hücre görüntüleme uygulaması, ilk olarak sabit bir cAMP gradiyenti (Şekil 4A-C) maruz hücre bifazik PIP3 üretim göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme uygulamak, dinamikleri sistematik olarak ölçülen yön-algılama PIP3 üretim (Şekil 4D, E) cAMP stimülasyon belirli sinyalizasyon ağı.
  5. Eşzamanlı izleme şekilde uygulanmaktadır cAMP stimülasyon üzerine heterotrimeric G-protein aktivasyonu ve PIP 3 üretim. Förster rezonans enerji transferi (kısaltılmış FRET) cAMP stimülasyon üzerine heterotrimeric G protein aktivasyonu (disosiasyon) izlemek için etkili bir yaklaşım sağlar. Burada, değişim ve PIP membran translokasyonu sırasıyla 3 probu, PH-G ve PH hücreler, GFP, FRET izleme (Şekil 5 heterotrimeric G protein aktivasyonu ve PIP 3 üretim eşzamanlı ölçümü için bir kolay kolay kabul sistemi tarif .) Bir şekilde uygulanmaktadır cAMP stimülasyon, geçici bir PIP 3 üretim tetikleyen ise, kalıcı bir G protein aktivasyonunu tetikler.

Şekil 1
Şekil 1: D. mükemmel bir model sistem GPCR aracılı kemotaksis diskodeyum. A. Programı yönlü algılama kısa bir sinyal yolağı gösterir. B. cAMP degrade D. hızlı kemotaksis indükler diskodeyum hücreleri. Hücreler PIP 3 probu, PH-GFP (Yeşil) ifade eder. Gradient Alexa 594 (Kırmızı) tarafından görüntülenmiştir. Ölçek çubuğu = 50μm.

Şekil 2
Şekil 2: görünür ve manipüle chemoattract alanlar altında hücreleri Kemotaksis. Doğrusal bir ilişki bir degrade cAMP konsantrasyonu B. Kantitatif ölçüm A. Grafik 2 mcM cAMP 10 mcg / mL Alexa 594 ile karışık bir seyreltme dizi cAMP konsantrasyonu ve floresan boya Alexa 594 yoğunluğu arasında doğrusal bir ilişki gösterir. A. floresan boya Alexa 594 cAMP konsantrasyonu ve yoğunluğu

Şekil 3
Şekil 3: Hücre hücre polarizasyon ve yön algılama ile motilite Kuplajsız. A. Görüntü aktin polimerizasyonu inhibitörü Latrunculin B tedavisi ile hareketsiz hücreler yönlü algılama yeteneği korumak olduğunu göstermektedir. Hücreler PIP 3 probu, PH-GFP (Yeşil) ifade eder. Gradient Alexa 594 (Kırmızı) tarafından görüntülenmiştir. B. manipüle cAMP uyarılması ve hareketsiz hücre sistemi yönlü algılama anahtar sorular adresi sağlar. Ölçek çubuğu = 10μm.

Şekil 4
Şekil 4: istikrarlı bir degrade maruz kalma üzerine sinyalizasyon ağı chemosensing kinetiği Sistemik ölçümleri. A. Montaj C. C sunulan PIP 3 üretim kinetiği ölçümü için sabit bir cAMP gradiyenti (Kırmızı) maruz kaldığı hücrenin bir bifazik PIP 3 üretim (Yeşil) B. Görüntü çıkarlarının bölgeler (ROI) gösterir . Kinetik of istikrarlı bir degrade maruz kalan hücrelerde PIP 3 üretim D. Programı cAMP stimülasyon PIP 3 üretim yönlü algılama sinyalizasyon ağı gösterir. Onların kinetiği üzerine istikrarlı bir degrade maruz E aynı renk düz çizgiler sunulmuştur.

Şekil 5
Şekil 5: GPCR sinyalizasyon ağları aynı anda izleme çoklu olaylar. A. Programı heterotrimeric G protein aktivasyonu ve PIP 3 üretim değişikliği ve sırasıyla PIP3 probu, G ve PH hücrelerinin PH-GFP, membran translokasyonu FRET izleme eş zamanlı ölçümü gösterir. B. Montaj G ve PH hücreleri gökkuşağı görüntüleri gösterir geçici bir PIP3 üretim tetikleyen ise, düzgün uygulanan cAMP stimülasyon, periferik hücre kalıcı bir G protein aktivasyonunu tetikler. Zaman noktalarında 4.9s, 10.2s ve 20.4s önce (0s) ve stimülasyon sonrası C. G protein aktivasyonu ve düzgün uygulanan cAMP stimülasyon üzerine PIP3 üretim Kinetik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hücrelerin kemotaktik yetkili sahne ulaşma süreçleri

Vahşi tip D. diskodeyum hücreleri, onu alır, yaklaşık 5 ~ 6 saat oda sıcaklığında geliştirme darbeli, hücreler de kutuplaşmış bir hücresel morfoloji ve hızlı hücre göçü (Şekil 1) görüntüleme sırasında iyi bir kemotaktik yetkili sahne onları ikna etmek için. Nabız gibi atan, sıcaklık ve farklı genetik geçmişleri cAMP konsantrasyonu gibi çeşitli faktörler, kemotaktik yetkili evre ulaşma süreci etkileyebilir. CAMP degrade kılavuzları hücreleri cAMP kaynağı, kemotaksis olarak belirlenmiş bir yönetmenliğini hücre göçü doğru hareket. Polarize morfolojisi ve hızlı hücre hareketi Ancak, yetersiz gelişimi ya da genetik arka plan nedeniyle kemotaktik yetkili sahne ulaşamamış hücrelerin iki tipik özelliklerini göstermek olmayabilir. Diğer taraftan, aşırı-geliştirme nedeniyle kemotaktik yetkili aşamaya geçti hücreleri genellikle görüntüleme deneyleri için tek tek hücrelerin ayırmak çok zordur hücreleri kümeleri, form ..

1. Görünür ve manipüle kemoatraktan degrade Görüntüleme chemotaxing hücreleri

Bu deneysel bir sistem içine floresan etiketli ve manipüle kemoatraktan stimülasyonu uygulamak için teknik bir ilerlemedir. Tarihsel olarak, biz ya homojen hücre morfolojisi ve davranışlarını gözlemlemek için uygulanan stimülasyon (üniform stimülasyon denir) ya da degrade stimülasyon uygulanan vardı. Bununla birlikte, bir "kör" uyarılması uyaranlara hücreleri nasıl ulaşır hiçbir tempo-uzamsal bilgiyi gösterir, bu nedenle hücre yanıtlarının herhangi bir "anormal" gözlemlere şüpheler atmalarını. Burada, floresan boya bir uygulama (Alexa594, Moleküler Probe) kemoatraktan ve izlenir floresan günün yoğunluğu ve konsantrasyonu (Şekil 2A, B) arasında doğrusal bir ilişki kurmak için kemoatraktan göstermektedir. Yeşil floresan protein (GFP) ve floresan boya (Alexa594) Bu uyarının üzerine uyarılması ve hücre yanıtlarının (Şekil 2C) izlemenize olanak sağlar kırmızı bir emisyon alınmasının bir kombinasyonu.

Deneysel ihtiyacına göre, daha fazla kombinasyonlar vardır. Yeni bir floresan boya dikkate alındığında, floresan, özellikle bir degrade deney için, Denemeniz için uygundur onaylamak için kritik uyaranlara ve floresan boya difüzyon co-verimlilik onaylamak için önemlidir. Ayrıca, karışık floresan boya konsantrasyonu ve yoğunluğu uyaranlara doğrusal bir ilişki elde etmek için, uyaranların yoğunluğu doygunluğu olmadan maksimum konsantrasyon elde etmek için gerekli.

2. TAŞINMAZ nonpolarized hücresi sistemi, canlı hücre görüntüleme kolaylaştırır

Kemotaksis karmaşık bir hücresel süreçtir; Ancak, bu üç temel yönlerini içine disseke: hücresel kutuplaşma, hareketliliği ve yön algılama. Morfolojik Bir kutuplaşma açıkça tanımlanmış bir lider bir hücrenin ön ve sondaki sonuna denir. Kemotaksis içinde yer alan birçok sinyalizasyon bileşenleri kutuplaşmış bir hücrelerinde fornt veya arka yerelleştirilmesine. Yön algılama, kutuplaşmış bir hücre içi biyokimyasal kutuplaşma içine ekstraselüler degrade çevirmek için bir hücrenin yetenektir. Şekil. 3A, aktin polimerizasyonu inhibitörü (Latrunculin B) ile tedavi hücrelerinin hücre motilite ve orijinal kutuplaşma hızla ortadan kaldırmaktadır. Çarpıcı, hücreler hücrelerin yönlü algılama olabilir belirten hala bir hücre içi kutuplaşma, degrade (PIP3biosensor bir hilal, PH-GFP gösterildiği gibi) karşı karşıya hücrelerin önünde PIP 3 birikimi olarak kurabilecektir hücre kutuplaşma ve hücre hareketi Kuplajsız. Bu polarize olmayan hücre sistemi, hücre motilite ve önceki kutuplaşma komplikasyon olmadan chemosensing için gerekli bileşenleri sinyal kinetiği belirlemenize olanak verir. Lehte ve aleyhte, aktin polimerizasyonu inhibitörü tedavisi tüm dinamiklerini aktin-hücre iskeletinin bakmakla yükümlü ortadan kaldırmaktadır

3. Multi-spektral canlı hücre görüntüleme İzleme sinyalizasyon ağı

Reseptörüne cAMP Nişan heterotrimeric G proteinin aktivasyonunu tetikler. Olarak sonradan Gβγ altbirim Gα altbirim ayrıdır ve mansap etkileyiciler PIP3 üretim gibi hücre yanıtlarını ikna etmek için harekete geçirir. Floresan mikroskopi tempo-mekansal çözünürlükte Teknik gelişmeler, canlı hücreleri hücre içi düzeyinde birçok sinyal olayların eşzamanlı görüntüleme izin verir. Bu bölümde, ilk izleme cAMP gradiyenti (Şekil 4A) ile birlikte iki sinyal moleküllerin eşzamanlı görüntüleme göstermektedir. Sonra, G aktivasyonu ve onun downstream hücre yanıtı PIP3 üretimi (Şekil 4B) spektral görüntüleme sunar. Försterfloresan rezonans enerji transferi, rezonans enerji transferi (RET) veya elektronik enerji transferi (EET) olarak da bilinen rezonans enerji transferi (kısaltılmış FRET), iki kromoforlar arasındaki enerji transferi açıklayan bir mekanizmadır. FRET: donör ve alıcı emisyon uyarma, uygun yönlendirme ve kısa mesafe (<10 nm) üst üste meydana gelmesi için üç kriter vardır. Iki moleküllerin uzaktan / yönlendirme gereksinimi, protein, protein-protein etkileşimleri veya intromolecular şekil değiştirirler saptamak için etkili bir yol olarak FRET kolaylaştırır. Burada, yaygın olarak kullanılan OBP / YFP çifti (Gα-CFP/Gβ-YFP) FRET canlı hücrelerde G protein α / βγ alt birimden dinamik ayrılma izlemek için kullanılır. Biz burada açıklanan akıllı bir deneysel tasarım bir hücreden tüm dinamiklerini ölçmek için uygun değildir, aynı zamanda G-protein aktivasyonu ve PIP3 üretim hem de izlemek için iki farklı tipte hücreleri karıştırmak için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma NIAID, NIH intramural fonu tarafından desteklenmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D3-T Growth Media KD Medical
Caffeine Sigma-Aldrich
Latrunculin B Molecular Probes, Life Technologies
Alexa 594 Molecular Probes, Life Technologies
cAMP Sigma-Aldrich
ChronTrol XT programmable timer ChronTrol Corp
Miniplus 3 peristaltic pump Gilbson
Platform rotary shaker
FemtoJet microcapillary pressure supply Eppendorf
Single- and four-well Lab-Tek II coverglass chambers Nalge Nunc international
LSM 510 META or equivalent fluorescent microscope Carl Zeiss, Inc. a 40X 1.3 NA or 60X 1.4 NA oil DIC Plan-Neofluar objective lens
Olympus X81 or equivalent Olympus Corporation Requires a 100X 1.47 NA TIRF objective lens

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lijima, M., Huang, Y. E., Devreotes, P. Temporal and spatial regulation of chemotaxis. Dev Cell. 3, 469-469 (2002).
  2. Murphy, P. M. The molecular biology of leukocyte chemoattractant receptors. Annu Rev Immunol. 12, 593-593 (1994).
  3. Devreotes, P. N. G protein-linked signaling pathways control the developmental program of Dictyostelium. Neuron. 12, 235-235 (1994).
  4. Jin, T., Xu, X., Hereld, D. Chemotaxis, chemokine receptors and human disease. Cytokine. 44, 1-1 (2008).
  5. Meier-Schellersheim, M. Key role of local regulation in chemosensing revealed by a new molecular interaction-based modeling method. PLoS Comput Biol. 2, e82-e82 (2006).
  6. Xu, X. Coupling mechanism of a GPCR and a heterotrimeric G protein during chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Sci Signal. 3, 71-71 (2010).
  7. Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Jiao, X., Nelson, L. E., Jin, T. Quantitative imaging of single live cells reveals spatiotemporal dynamics of multistep signaling events of chemoattractant gradient sensing in Dictyostelium. Mol Biol Cell. 16, ra71-ra71 (2005).
  8. Xu, X., Meier-Schellersheim, M., Yan, J., Jin, T. Locally controlled inhibitory mechanisms are involved in eukaryotic GPCR-mediated chemosensing. J. Cell Biol. 178, 141-141 (2007).
  9. Jin, T., Zhang, N., Long, Y., Parent, C. A., Devreotes, P. N. Localization of the G protein betagamma complex in living cells during chemotaxis. Science. 287, 1034-1034 (2000).
  10. Janetopoulos, C., Jin, T., Devreotes, P. Receptor-mediated activation of heterotrimeric G-proteins in living cells. Science. 291, 2408-2408 (2001).
  11. Funamoto, S., Milan, K., Meili, R., Firtel, R. A. Role of phosphatidylinositol 3' kinase and a downstream pleckstrin homology domain-containing protein in controlling chemotaxis in dictyostelium. J. Cell Biol. 153, 795-795 (2001).
  12. Li, Z. Roles of PLC-beta2 and -beta3 and PI3Kgamma in chemoattractant-mediated signal transduction. Science. 287, 1046-1046 (2000).
  13. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J. Cell Biol. 167, 505-505 (2004).
  14. Meili, R. Chemoattractant-mediated transient activation and membrane localization of Akt/PKB is required for efficient chemotaxis to cAMP in Dictyostelium. EMBO J. 18, 2092-2092 Forthcoming.
  15. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G protein signaling events are activated at the leading edge of chemotactic cells. Cell. 95, 81-81 (1998).
  16. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and temporal regulation of 3-phosphoinositides by PI 3-kinase and PTEN mediates chemotaxis. Cell. 109, 611-611 (2002).
  17. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor suppressor PTEN mediates sensing of chemoattractant gradients. Cell. 109, 599-599 (2002).
  18. Haastert, P. J. V. an, Devreotes, P. N. Chemotaxis: signalling the way forward. Nat Rev Mol Cell Biol. 5, 626-626 (2004).

Tags

Moleküler Biyoloji Sayı 55 kemotaksis yönlü algılama GPCR PCR G-proteinleri sinyal iletimi,
Görüntüleme G-protein Coupled Reseptör (GPCR) aracılı Sinyal Olaylar Kontrolü Kemotaksis<em> Diktiyostelyum diskodeyum</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein… More

Xu, X., Jin, T. Imaging G-protein Coupled Receptor (GPCR)-mediated Signaling Events that Control Chemotaxis of Dictyostelium Discoideum. J. Vis. Exp. (55), e3128, doi:10.3791/3128 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter