Summary
توضح هذه المقالة السطحية ووضع العلامات
Abstract
التشوهات الجنينية ظهائر الخضوع المعقدة (مثل الانحناء والبرم ، وقابلة للطي ، وتمتد) لتشكيل أجهزة بدائية للجنين في وقت مبكر. تتبع علامات إيمانية على أسطح هذه الأوراق الخليوي هي طريقة راسخة لتقدير كميات تخلقية مثل انكماش النمو والقص. ومع ذلك ، وليس وضع العلامات السطحية جميع التقنيات قابلة للتكيف بسهولة إلى طرائق التصوير التقليدية ، وتمتلك مزايا مختلفة والقيود. هنا ، نحن تصف طرق وضع العلامات اثنين وتوضيح فائدة كل أسلوب. في الأسلوب الأول ، يتم تطبيق المئات من التسميات الفلورية في الوقت نفسه إلى الجنين باستخدام جزيئات الحديد المغناطيسي. ثم يتم استخدام هذه التسميات لكمية تشوهات الأنسجة 2 - D أثناء التشكل. في الطريقة الثانية ، تستخدم المجهرية البوليسترين كعوامل التباين في غير الغازية التصوير الضوئي التماسك (أكتوبر) التصوير المقطعي لتتبع تشوهات الأنسجة 3 - D. وقد نجحت هذه التقنياتلاي تنفيذها في مختبرنا لstudythe الآليات المادية أضعاف رأس في وقت مبكر ، والقلب ، ونمو الدماغ ، وينبغي أن تكون قابلة للتكيف لعمليات واسعة النطاق التخلق.
Protocol
1. إعداد التجريبية العامة
- تحضير الأنسجة المتوسطة الثقافة في تدفق الصفحي هود.
- تمييع متوسطة Dulbecco في التعديل النسر (DMEM) (1 زجاجة لتر مع 4.5g / L الجلوكوز ، وبيكربونات الصوديوم ، ولام الجلوتامين). إضافة 10 مل من البنسلين / الستربتومايسين / النيوميسين المضادات الحيوية.
- إزالة 100 مل من DMEM مع ماصة نقل معقمة واستبدالها مع 100 مل من مصل الفرخ.
- قسامة الفرخ DMEM/10 ٪ المصل / المضادات الحيوية 1 ٪ في قوارير معقمة 15 مل المخروطية والتجميد.
- إعداد الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) تستكمل مع الكالسيوم والمغنيسيوم. مزيج 100 مل 10X PBS ، 900 مل ماء منزوع الأيونات ، و 1 مل من محلول الكالسيوم والمغنيسيوم تركزت (100 ملغ / مل CaCl 2 • 2H 2 O ، 100mg/mL MgCl 2 • 6H 2 O).
- يحضن البيض في اتجاه الطولي للمرحلة المطلوبة على النحو الذي حددته همبرغر وهاميلتون 1 (أي 23-25 ساعة لسمو المرحلة 5 ، أو 42-48 ساعة لمراحل سمو 11-12).
- إزالة الأجنة من البيض باستخدام الناقل رقة الترشيح الأسلوب.
- كسر قاع البيضة على جانب طبق بتري a150 ملم. مزق قذيفة من القاع وتفريغ محتويات البيض في طبق.
- إزالة سمكا ، وزلال البيض لزجة من استخدام الملقط حادة.
- قطع دوائر الطول Whatman 2-3 # 2 تصفية الورق. في القطر. به ثقب واحد لكمة ، لكمة ثقوب في وسط ورقة الترشيح. مكان واحد من الخواتم ورقة تصفية على صفار بطريقة تحافظ على الجنين وضوحا من خلال ثقب في وسط الحلبة.
- قطع في جميع أنحاء القطر الخارجي من ورقة الترشيح مع microscissors. إزالة الورق من صفار البيض مع ملقط الغرامة.
- الشطف بلطف الجنين في برنامج تلفزيوني لإزالة الجسيمات صفار ملتصقة. (قد HH5 الأجنة تحتاج إلى امتصاص ما دام 15-20 دقيقة لإزالة صفار المتبقية). إزالة التجميع ورقة مرشح من الحمام ووضعه الجانب بطني حتى في35 مم طبق الثقافة. المركز الثاني خاتم رقة الترشيح على قمة الأولى ، يقحم الجنين بين الحلقات. وضع حلقة معدنية في جميع أنحاء خارج من الساندويتش رقة الترشيح (≈ 1،5-2 قطرها سم) لتأمين الجنين.
- يغرق الجنين في المتوسط الثقافة. التحقق من التشكل الصحيح والمرحلة الجنينية مع المجهر حقل مشرق.
- مجتذب استخدام ماصة للتحضير غرامة الإبر طرف الزجاج (1.5 مم الداخلية) (آلات دقيقة العالمية ، ساراسوتا فلوريدا) لتشريح الأنسجة اللاحقة ، ووضع العلامات.
2. صلاح الغيدان وصفها في المرحلة 5 سمو الأجنة باستخدام جزيئات الحديد المغناطيسي
- إضافة بضع قطرات من الجاذبة المشبعة في الكحول على كمية صغيرة من مسحوق الحديد (الحديد المختزل ، مالينكرودت بيكر ، وشركة ، Phillipsburg ، NJ) في درجة حرارة الغرفة واسمحوا الجافة. (وهذا يؤدي عادة إلى جزيئات الكعكة معا مرة الكحول قد تبخرت.) استخدام غيض من micropipette سحبت لتفتيت جزيئات الحديد تجمعت ،نقلها إلى أنبوب microcentrifuge ، وشطف لهم عدة مرات ، وتغطي مع الماء منزوع الأيونات.
- لتسمية خلايا الأدمة في جنين سمو 5 المرحلة ، وضع الجنين المقطوع (أي كامل التجمع ورقة فلتر) الجانب الظهري حتى في صحن الثقافة 35 ملم مغطاة بطبقة سخية من وسائل الإعلام والثقافة ، ووضع صحن تحت المجهر تشريح. استخدام إبرة الزجاج لإزالة الغشاء المحي وكشف خلايا الأدمة. (احرص على الجنين لا يخترق.)
- رسم عمود من جزيئات الحديد المسمى (في الماء منزوع الأيونات) في ماصة باستور. تشريح باستخدام المجهر ، يغرق غيض ماصة تحت سطح السائل والموقف العادل فوق الجنين. المتداول ماصة ببطء وإيابا بين الأصابع ، على شد جزيئات من pipiette ويرش عليها عبر الجنين.
- مرة واحدة تتناول الجنين مع الجزيئات والمكان بعناية في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا. يأخذ الجنين للخروج من الحاضنة anد استخدام مغناطيس قوي لإزالة الجسيمات.
- استخدام المجهر الفلورسنت مع كاميرا الفيديو المرفقة والإعدادات المناسبة للحصول على تصفية كل من الميدان والصور المشرقة الفلورسنت الجنين ، كما هو مبين في الشكل 2A ، B.
- لاحظ كثافة التسمية. إذا كان المطلوب هو توزيع كثافة استخدام جزيئات إضافية (كما هو موضح أعلاه) لتسمية الجنين مرة أخرى ، وتمديد فترة حضانة وفقا لذلك. إذا كانت التسميات كثيفة جدا ، إضافة كمية صغيرة من جزيئات الحديد غير المسماة في أنبوب microcentrifuge مليئة الجسيمات المسمى بالفعل وخلط محتويات الأنبوب. كرر العملية مع وضع العلامات جنين جديد ، ومرة أخرى نلاحظ كثافة التسمية.
3. البوليسترين وصفها Microsphere التصوير الضوئي للبالاتساق (أكتوبر) من التصوير المقطعي HH11 - 12 الأجنة
- يعد حل السوداء المجهرية قطرها 10 ميكرومتر (Polysciences شركة ، وارينغتون ، والسلطة الفلسطينية) في برنامج تلفزيوني في طبق بتري 35 مم. (يجب أن تكون كبيرة بما يكفي الخرز لتوليد النقيض للأكتوبرالتصوير ، ولكن صغيرة بما يكفي بحيث حجم حبة وبناء على أمر من الخلايا الفردية وقيم معينة تختلف تبعا لقرار النظام الخاص أكتوبر وتجرى حاليا دراسة الأنسجة). قطرة واحدة من محلول المخزون (2.6 ٪ مواد صلبة ، لاتكس) لكل مليلتر من برنامج تلفزيوني عموما كافية. سحب هذا المحلول إلى حقنة 10cc باستخدام إبرة قياس 22. دوامة الحل لمدة 30 ثانية لضمان توزيع موحد حبة.
- شطبة نصائح من الإبر والزجاج الخاص سحبت باستخدام محرك الصلب لجهاز الكمبيوتر 2. وينبغي أن تكون كبيرة قطرها غيض يكفي أن حبات يمكن احتواؤها من خلال فتح ، ولكن في نفس الوقت ، صغيرة ممكن للتقليل من إصابة الأنسجة أثناء الحقن.
- شغل الإبرة زجاج مشطوف مع الحل حبة باستخدام حقنة. نفض الغبار micropipette طفيفة لضمان أن الحل قد وصل إلى الحافة.
- باستخدام micromanipulator ، ومكان الإبرة الزجاج في نفس المجال لعرض والجنين. وينبغي أن تكون حبات المتدفقة من طرف ماصة.
- إذا لم BEAس إنهاء micropipette ، قد يكون هناك انسداد. في هذه الحالة ، كرر الخطوات من 3،2-3،4 بإبرة الزجاج الجديد.
- إذا كان الكثير من الخرز سحابة مجال نظرك ، قد يكون الطرف الخاص ماصة واسعة جدا. كرر الخطوات من 3،2-3،4 مع ماصة جديدة والجنين الجديد.
- إدراج غيض ماصة في تجويف الأنبوب الدماغ. تأكد من عدم اختراق الكلمة البطنية من الأنسجة. سترى عابرة تورم الأنسجة والخرز وسائل دخول لمعة. هذا يدل على نجاح التنبيب ، والآن ، بسرعة إزالة الإبرة الزجاج.
- التحقق من كثافة كافية حبة في التجويف الداخلي للأنبوب المخ باستخدام المجهر حقل مشرق. اسمحوا حبات تسوية لمدة 20 -- 30 دقيقة قبل الشروع في الطائفة. 4.
4. الحصول على البيانات
وتلائم * الأساليب التالية للحصول على تقنية وضع العلامات مضان المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، مع تقنية microsphere وضع العلامات ، ويمكن حبات طرد عند نقل العيناتبين الحاضنات ونظم التصوير. في هذه الحالة فمن الأفضل للشروع في خطوة 4.2 (والذي يتجنب عينة حركة / الهياج تماما). في كلتا الطريقتين ، يتم تربيتها في حين غمرت الأجنة في مستنبت السائل. وإذا لم يكن الجنين مغمورة تماما (كما هو الحال مع بعض تقنيات زراعة الأنسجة التقليدية) ، وغيرت كثيرا هندسة الأنسجة بشكل غير طبيعي من قبل ارتفاع الأحمال التوتر السطحي والتوزيعات سلالة تفشل في التقاط بدقة العادي 3 - D التشكل 3 ، 4. علاوة على ذلك ، غمر النسيج يمنع التباين مشرق لوحظ في واجهة الغاز السائل خلال التصوير أكتوبر من التعتيم التشكل الجنيني وينسق علامة.
- الجنين الثقافة (عامة)
- بعد الحصول على الصور الأولى (حقل مشرق ، ومضان ، أو أكتوبر) ، وطرح ما يصل الى سبعة أطباق 35 ملم الثقافة (مع الأجنة) في طبق بتري 150 ملم ومكان التجميع كلها في كيس صغير من البلاستيك. إضافة بضع قطرات من ماء منزوع الأيونات في كيس لترطيبوملء الحقيبة مع O 95 ٪ 05/02 ٪ CO 2 الخليط. وضع الأجنة في حاضنة عند 37 درجة مئوية (طابور Stabiletherm ، أشفيل ، كارولينا الشمالية) للمرة المرجوة حتى timepoint التصوير المقبل. باستخدام هذا الأسلوب ، يمكن إجراء تجارب على أجنة متعددة في نفس اليوم.
- الوقت الفاصل بين الثقافة (الآلي)
- المكان المسمى الخاص الأجنة في صحن تي الدلتا (35 مم الخارجي ، و 23 ملم مع فتحة وسط الجدار الجانب مدبب ، والزجاج السميك 0.17mm ؛ Bioptechs ، بتلر ، والسلطة الفلسطينية) التي تحتوي على 1.2 مل من المتوسط الثقافة.
- تغطية صحن مع غطاء زجاجي يحتفظ بها في 37 درجة مئوية باستخدام دلتا Bioptechs الطبق الثقافة T4 المراقب (لمنع التكثف). Superfuse الجنين مع O 95 ٪ 05/02 ٪ خليط أكسيد الكربون غاز 2 المرفق من جهاز التدفق المتغير ميني مضخة (فيشر العلمية). قبل التوصل إلى الجنين ، والحرارة وترطيب الغاز التي ظهرت على السطح من خلال الماء منزوع الأيونات على الحارة (<100 درجة مئوية) لوحة ساخنة. والتخطيطي لهذه التجارب لياليويرد آخرون المتابعة في الشكل 1.
- إعداد برامج للحصول على الصور تلقائيا في فترات زمنية محددة من قبل المستخدم. لدينا مضان المجهر ، ونحن نستخدم Openlab البرمجيات (PerkinElmer ، التايم ، ماجستير) ، ونظام أكتوبر لدينا ، ونحن نستخدم اجتاحت مصدر Thorlabs البرمجيات (نيوتن ، نيوجيرسي) ، ولأن هذا الأسلوب هو الوحيد القادر على التعامل مع لمرة واحدة انقضاء التجربة في وقت واحد ، غالبا ما يكون من الأفضل أن تسمح هذه الأنواع من الثقافات لتشغيل بين عشية وضحاها. يمكن للمرء أن الالتفاف على هذا التحديد عن طريق تثبيت مرحلة ترجمة الآلية متوافقة مع الأجهزة والبرمجيات على حد سواء للنظام التصوير 5.
5. ممثل النتائج :
يتم تعقب التسميات تلقائيا (باستخدام Volocity ، PerkinElmer) أو يدويا (باستخدام البرنامج المساعد المختصر في تعقب ImageJ ، NIH) في كل تجربة. في تقنية وضع العلامات الفلورسنت ، ونستخدم gridfit الروتينية مطلب لتناسب الأسطح 2D من خلال إحداثيات علامة ، والتي تمكن سلالات سطح تخلقية تحسب 6 ، 7. وتستخدم المعادلات القياسية لتحويل هذه القيم إلى نظام تنسيق الجنينية ذات الصلة. بدلا من ذلك ، يمكن أن تحسب في تقنية أكتوبر ، يتم إنشاء وحدات التخزين من السطوح صورة مجزأة (التي تم الحصول عليها عن طريق البرامج القياسية مثل مطلب أو الإقحام 8) والسلالات في اتجاه الانحناء الأقصى أو الحد الأدنى من العينة 9.
استخدمنا تقنية الجسيمات الحديد لدينا تسمية وتتبع حركة خلايا الأدمة خلال تشكيل رئيس أضعاف في جنين الفرخ المبكر. وكما هو مبين في الشكل 2A ، موزعة عبر خلايا fluorescently المسمى الجنين بأكمله. تم القبض على الميدان والصور المشرقة الفلورسنت الجنين في فترات مختلفة خلال ثقافة البيضة السابقين. ثم استخدمت حركات التسميات مجنزرة (الشكل 2B ، C) لحساب سلالة تخلقية المتطورة التوزيعات خلال تشكيل طية الرأس (الشكل 2D - F).
وكانت ر "> وبالمثل ، كان يستخدم أسلوبنا microsphere البوليسترين لتعقب تحركات الأنسجة عند حدود منتصف الدماغ المؤخر من الدماغ في وقت مبكر الفرخ وكما هو مبين في الشكل 3 دينار بحريني ، تتبعت الاقتراحات حبة لمدة 6 ساعات وتوصيف سلالات تشوه في الأنسجة الطولية و وقد حسبت الاتجاهات كفافي من علامة الإحداثيات. لاحظ أن هذه الطريقة هي قادرة على التعامل بوضوح 3 - D التشوهات والخرز تميل إلى عصا لجميع الاطراف من التجويف الداخلي للدماغ (الشكل 3A).
الشكل 1. تخطيطي من إنشاء لزراعة الأنسجة مرور الزمن.
الشكل 2. التحديد الكمي 2 مد الأنسجة تشوهات في الجنين الفرخ المبكر باستخدام تسميات الفلورسنت مجنزرة. (أ) مشرق مدموجة الحقل / فلوري صورة الجنين سمو 5 المرحلة بعد إزالة جزيئات الحديد. التسمية الجاذبةويتم توزيع الطبعة خلايا الأدمة (الحمراء) عبر الجنين بأكمله. (B ، C) وتعقب حركة الخلايا المسمى ImageJ به. وحسبت إحداثيات التشريد التسمية في جنين (X ، Y). لاحظ أن A و B هي نفس الصورة. (مدافع) المؤامرات كونتور للتطور توزيعات الضغط الطولي خلال تشكيل رئيس أضعاف. حسبت طولية سلالات لاغرانج النسبي لسمو المرحلة 5 (أي A و B) بعد 75 دقيقة (D) ، (E) 120 دقيقة ، و (F) 165 دقيقة من الحضانة. هذه السلالات تتميز التغييرات طول الخط من العناصر الموجهة أصلا على طول المحور Y (في مرحلة الجنين 5). ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل حول استخدام التسمية لحساب إحداثيات مجنزرة سلالات التخلق في Filas آخرون (2007) (6) وVarner وآخرون (2010) 7. لاحظ أن C و F هي نفس الصورة. مقياس بار = 500 ميكرون.
الشكل 3. D - 3 تحديد مقدار الأنسجة دeformations الفرخ في الدماغ في وقت مبكر. (أ) البوليستيرين المجهرية التي تلتزم (السهم الأسود) في ظهري وبطني (السهم الأبيض) من جانبي أنبوب الدماغ تتجلى بسهولة من الأنسجة المحيطة بها في وجهات النظر عبر عرضية section.Ventral من اعادة بناء مواقع المعرض microsphere أكتوبر بالقرب من حدود منتصف الدماغ المؤخر في (ب) وبعد HH12 (C) 6 ساعة من الحضانة (M : المخ الأوسط ، H : الدماغ المؤخر). وترد عدة مجموعات من الخرز لتسليط الضوء على التشوه العام للأنسجة. (D) الطولية (E ZZ) وكفافي (E θθ) حسبت لاغرانج سلالات من هذه التشوهات. سلالات الإيجابية والسلبية كفافي طولية في حدود منتصف الدماغ المؤخر تعكس محورية تطويل وتقصير كفافي في هذه المنطقة خلال الثقافة. ويمكن الاطلاع على مزيد من التفاصيل على حساب السلالات تخلقية للأسطح معقدة خلال التشكل في Filas آخرون (2008) 9. مقياس بار = 200 ميكرون.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وتعرض اثنين من التقنيات لوضع العلامات نسيج الثقافة البيضة السابقين لافراخ الدجاج في وقت مبكر. الأول يستخدم الأصباغ الفلورية محبة للدهون تسليمها عبر جزيئات الحديد المغناطيسي في وقت واحد لتسمية مئات من الخلايا. ومع ذلك ، هذا الأسلوب هو حاليا غير متوافق مع التصوير المقطعي التماسك البصري ، والأصباغ الفلورية تظهر عادة على النقيض القليل من الأنسجة المحيطة به 10 أكتوبر. وبالتالي ، فإننا تظهر باستخدام تقنية بديلة المجهرية البوليسترين لتسمية الأنسجة للتحليل أكتوبر مرور الزمن. هذه التقنية غلة قواعد البيانات 3 - D ولكن يجب الحرص على عدم طرد حبات من الأنسجة. وينبغي أن تستخدم إما واحد من هذه الأساليب التجريبية في وضع العلامات المناسبة تقدم موثوق الأنسجة البيضة والتنمية السابقين في الأجنة المبكرة. كلا أساليب استخدام متاحة بسهولة ، ذات التكلفة المنخفضة نسبيا المواد (على سبيل المثال ، مسحوق الحديد ، البوليسترين المجهرية) وتمكين تشوه النسيج لتكون كميا خلال التشكل. ويمكن علامات الأنسجة في كلتا الحالتين يكون من السهل تطبيقها على وبتكاثر الخلايا الجنينية ولا تتطلب معدات متخصصة ، مما يجعل هذه التجارب للوصول للقادمين الجدد في هذا المجال. يجب تصور وتحليل البيانات الناتجة (على سبيل المثال ، من خلال خرائط الحوسبة سلالة التخلق) تساعد على توضيح آليات التشكل في نموذج النظام الخاص 6 ، 7 ، 9 ، 11 ، 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 R01 GM075200 وHL083393 (LAT). نعترف زمالات لدعم BAF من المعاهد الوطنية للصحة T90 DA022871 ومعهد مالينكرودت من الأشعة ، وللVDV من منحة 09PRE2060795 من رابطة القلب الاميركية
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM — high glucose | Sigma-Aldrich | D5796 | |
| Penicillin/Streptomycin/Neomycin | Sigma-Aldrich | P4083 | |
| Chicken Serum | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D1408 | 10X |
| Whatman #2 Filter Paper | Whatman, GE Healthcare | 1002 090 | 90mm diameter |
| Glass Micropipettes | World Precision Instruments, Inc. | TW150-6 | 1.5mm inner diameter |
| DiI | Invitrogen | D-282 | |
| Iron Reduced | Mallinckrodt Baker Inc. | 5320 | |
| 10 μm Diameter Microspheres (black) | Polysciences, Inc. | 24294 | |
| Delta T Dish (for time lapse culture) | Bioptechs | 04200415B | 0.17mm thick, black |
| Delta T4 Culture Dish Controller | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| Mini-Pump Variable Flow Device | Fisher Scientific |
References
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
- Voronov, D. A., Taber, L. A. Cardiac looping in experimental conditions: the effects of extraembryonic forces. Developmental Dynamics. 224, 413-421 (2002).
- Filas, B. A., Bayly, P. V., Taber, L. A. Mechanical stress as a regulator of cytoskeletal contractility and nuclear shape in embryonic epithelia. Ann. Biomed. Eng. 39, 443-454 (2011).
- Kozel, B. A. Elastic fiber formation: a dynamic view of extracellular matrix assembly using timer reporters. J. Cell. Physiol. 207, 87-96 (2006).
- Filas, B. A., Efimov, I. R., Taber, L. A. Optical coherence tomography as a tool for measuring morphogenetic deformation of the looping heart. Anat. Rec. 290, 1057-1068 (2007).
- Varner, V. D., Voronov, D. A., Taber, L. A. Mechanics of head fold formation: investigating tissue-level forces during early development. Development. 137, 3801-3811 (2010).
- Van Essen, D. C. An integrated software suite for surface-based analyses of cerebral cortex. J. Am. Med. Inform. Assoc. 8, 443-459 (2001).
- Filas, B. A., Knutsen, A. K., Bayly, P. V., Taber, L. A. A new method for measuring deformation of folding surfaces during morphogenesis. J. Biomech. Eng. 130, 061010-061010 (2008).
- Yuan, S. Co-registered optical coherence tomography and fluorescence molecular imaging for simultaneous morphological and molecular imaging. Phys. Med. Biol. 55, 191-206 (2010).
- Zamir, E. A., Czirok, A., Rongish, B. J., Little, C. D. A digital image-based method for computational tissue fate mapping during early avian morphogenesis. Ann. Biomed. Eng. 33, 854-865 (2005).
- Blanchard, G. B. Tissue tectonics: morphogenetic strain rates, cell shape change and intercalation. Nat. Methods. 6, 458-464 (2009).
