이 문서는 표면 레이블 및 설명 전 비켜 조직 문화. 시간이 경과 명시야, 형광, 광학 일관성 tomography 이미징 의무 기법 제공됩니다. 높은 spatiotemporal 해상도 추적 표면 레이블은 둘 그리고 셋 차원 모두에서 계산하는 morphogenetic의 변종 (deformations)로 동점 수량을 수 있습니다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
배아 상피 조직은 초기 배아의 원시 장기를 형성하기 위해 복잡한 deformations (예, 굽힘 비틀림, 접이식, 그리고 스트레칭) 받다. 이러한 세포 시트의 표면에 fiducial 마커를 추적하는 것은 같은 성장, 수축 및 전단 등 morphogenetic 수량을 계산하는 잘 구축 방법입니다. 그러나, 모든 표면 분류 기술은 기존 영상 modalities에 쉽게 적응하고 서로 다른 장점과 한계를 가지고있다. 여기, 우리는 두 가지 분류 방법을 설명하고 각 기술의 유틸리티를 보여줍니다. 첫 번째 방법에서는 형광 라벨의 수백 자기 철분 입자를 사용하여 배 (胚)에 동시에 적용됩니다. 이러한 라벨은 다음 morphogenesis 중에 2 - D 조직 deformations 수량하는 데 사용됩니다. 두 번째 방법에서는 폴리스티렌 microspheres는 3 - D 조직 deformations를 추적하는 비침습 광학 일관성 tomography (-10 월) 이미지의 대비 요원으로 사용됩니다. 이 기술은 성공적인 것으로정 일찍 머리를 접어, 심장, 뇌 개발의 물리적 메커니즘을 studythe하기 위해 실험실에서 구현하고, 다양한 범위 morphogenetic 프로세스에 적용할 수 있어야합니다.
프로토콜
1. 일반 실험 준비
- 층류 흐름 후드의 조직 문화 매체를 준비합니다.
- Dulbecco의 수정된 이글 배지 (DMEM) (1 4.5g / L 포도당과 L 병, 나트륨 중탄산염, 그리고 L - 글루타민)을 희석. 10 ML 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 네오 마이신 항생제를 추가합니다.
- 멸균 전송 피펫과 DMEM의 100 ML을 제거하고 여자는 혈청 100 ML로 바꿉니다.
- 나누어지는 무균 15 ML 원뿔 튜브 및 동결에 DMEM/10 %의 여자는 혈청 / 1 %의 항생제.
- 인산염을 준비 칼슘과 마그네슘으로 보충 식염수 (PBS)는 버퍼. 100 ML 10X PBS, 900 ML 탈이온수, 그리고 농축 칼슘, 마그네슘 용액 (100 MG / ML CaCl 2 • 2 시간 2 O, 100mg/mL MgCl 2 • 6H 2 O) 1 ML을 섞는다.
- 햄버거와 해밀턴 1 (즉, 23-25 HH 단계 5 시간 또는 42에 의해 정의된 원하는대로 무대에 세로 방향으로 알을 품어HH 단계 11-12)에 대한 -48 시간.
- 필터 종이 캐리어 방법을 사용하여 난자에서....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
두 조직 분류 기술은 초기에 여자는 태아의 전 비켜 문화 제공됩니다. 첫 번째는 동시에 세포의 수백 라벨 자기 철 입자를 통해 제공되는 형광 염료 lipophilic를 사용합니다. 형광 염료는 일반적으로 10월 10일를 사용하여 주변 조직에서 약간의 대비를 보여주 그러나이 방법은 현재 광학 일관성의 tomography와 호환되지 않습니다. 따라서, 우리는 시간 경과 OCT 분석을위한 조직을 레이블에 폴리스티렌 microspheres를 사용하여 다른 방법을 보여줍니다. 이 기술은 3 - D 데이터 세트를 산출하지만, 관리는 조직에서 구슬을 이동시키다하지 않도록해야합니다. 적절한 실험 설정에서 이러한 방법 중 하나를 사용하면 초기 배아에서 신뢰할 수있는 조직 라벨 및 전 비켜 개발을 제공해야합니다. 두 가지 방법이 쉽게 사용할 수, 상대적으로 저렴한 비용으로 재료 (예, 철 분말, 폴리스티렌 microspheres)를 사용하고 morphogenesis 동안 계량하는 조직 변형을 .......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 NIH 보조금 R01 GM075200 및 R01 HL083393 (LAT)에 의해 지원되었다. 우리는 NIH T90 DA022871와 방사선과의 Mallinckrodt 연구소에서 BAF를위한 친목 지원을 인정하고, 미국 심장 협회에서 부여 09PRE2060795에서 VDV하십시오.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 재료 / 시약 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| DMEM - 높은 포도당 | 시그마 - 올드 리치 | D5796 | |
| 페니실린 / 스트렙토 마이신 / 네오 마이신 | 시그마 - 올드 리치 | P4083 | |
| 치킨 세럼 | Invitrogen | 16110-082 | |
| Dulbecco의 인산은 식염수 버퍼 | 시그마 - 올드 리치 | D1408 | 10X |
| 워트 먼지 # 2 필터 용지 | 워트 먼지 | 1002 090 | 90mm 직경 |
| 유리 Micropipettes | 세계 정밀인 스트 루먼트 (WPI) | TW150 - 6 | 1.5mm 내경 |
| DiI | Invitrogen | D - 282 | |
| 아이언은 감소 | Mallinckrodt 베이커 주식 회사 | 5320 | |
| 10 μm의 직경 Microspheres (검정) | Polysciences 주식 회사 | 24,294 | |
| 델타 T 접시 (시간 저속 문화에 대한) | Bioptechs | 04200415B | 두께, 블랙 0.17mm |
| 델타 T4 문화 요리 컨트롤러 | Bioptechs | 0420-4-03 | |
| 미니 펌프 가변 흐름 장치 | 피셔 과학 |
참고문헌
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
- Canfield, J. G. Dry beveling micropipettes using a computer hard drive. J. Neurosci. Methods. 158, 19-21 (2006).
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
