Med hjälp av en jämförande Arter metoden för att undersöka neurobiologi av Paternal svar

Summary

Den jämförande arter tillvägagångssätt tillåter beteende neuroforskare att utforska olika neurobiologiska faktorer som är förknippade med specifika beteenden ses som kännetecknande för en viss djurmodell. Med utnyttjande av naturligt förekommande skillnader i beteende mellan närbesläktade arter, kräver denna teknik inte invasiva tekniker för att manipulera uttrycket för beteendet.

Abstract

Ett mål för beteendevetenskap neurovetenskap är att identifiera bakomliggande neurobiologiska faktorer som reglerar specifika beteenden. Med hjälp av djurmodeller för att uppnå detta mål, många metodologiska strategier kräver invasiva tekniker för att manipulera intensiteten i beteendet av intresse (t.ex. lesion metoder, farmakologiska manipulationer, mikrodialys teknik, genetiskt modifierade djurmodeller). Utnyttjandet av en komparativ art tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att dra fördel av naturligt förekommande skillnader i åtgärdsstrategier som finns i närbesläktade arter. I vårt labb använder vi två arter av Peromyscus släkte som skiljer sig i faderns svar. Den manliga Kalifornien rådjur musen (Peromyscus californicus) uppvisar samma föräldrarnas svar som den kvinnliga medan dess kusin, uppvisar gemensamma rådjur musen (Peromyscus maniculatus) nästan ingen näring / föräldrarnas svar i närvaro av valpar. Av särskilt intresse i denna artikel är en utforskning av de neurobiologiska faktorer som är förknippade med Samförstående sociala svar ut av den faderliga Kalifornien rådjur mus. Eftersom beteende neurovetenskap strategi är mångfacetterad, kommer följande viktiga komponenter i studien kortfattat behandlas: identifiering av lämpliga arter för denna typ av forskning, datainsamling för beteendeanalys, förberedelse och sektionering av hjärnorna, grundläggande stegen i immuncytokemi för kvantifiering av vasopressin-immunreaktivitet, användning av neuroradiologiska programvara för att kvantifiera hjärnvävnaden, användningen av en microsequencing videoanalys att göra mål beteende och slutligen till lämpliga statistiska analyser ge den mest informerade tolkningar av forskningsresultat.

Protocol

1. Identifiering av djurmodell

1. California Deer Mus (Peromyscus californicus) är en perfekt modell för att utforska faderliga svar. Som ni ser, ryttare här musen valparna precis som mammor gör - de ens huka över dem så att det ser ut som valpar är omvårdnad. Beteendet hos den kaliforniska möss är jämfört med en art av samma släkte, den gemensamma rådjur musen (Peromyscus maniculatus) vilket litet intresse hos ungarna utställningar, ofta försöker fly eller ens attackera dem. (Se figur 1 för bilder på dessa arter interagera med valpar.)
2. När arten modellen har identifierats sedan de olika grupperna måste fastställas. I denna studie är biologiska fäder, jungfrur utan föräldraskap erfarenhet, och jungfrur med begränsad valp exponering (pup-exponerade eller främja fäder) av såväl arter som används så att både predisponerade och förvärvade faderliga egenskaper kan bedömas. I denna studie har vi utsätts också alla grupper till en leksak mus valp för att säkerställa att de sociala interaktioner var specifika för en valp och inte ett representativt svar på vad som helst placeras i buren (se figur 2.)
3. Innan vi undersöker neurobiologiska faktorer, är det viktigt att bekräfta att vissa arter uppvisar tydliga skillnader i beteendet av intresse. I denna studie är män placeras i en bur med en valp i fem minuter och en faderlig beteende ethogram (se tabell 1 för exempel på ethogram) används för att göra mål beteenden såsom latens närma sig valpen och tid tillbringas i kontakt med valpen. Om aggressiva reaktioner observeras, är valpen bort omedelbart. Dessa sessioner är ofta videofilmade så en noggrann beteendeanalys senare kan genomföras.

2. Förbereda hjärnvävnad

1. Efter en standard perfusion av varje mus (protokoll bifogas), är hjärnan bort så att de kan sektioneras i de specifika intresseområde (visa hjärnan).
2. En vanlig mus hjärnan Atlas (visa Atlas) används för att lokalisera paraventricular kärnan i hypotalamus, ett område känt för att vara rik på celler som producerar de neuropeptid av intresse i denna studie - vasopressin (AVP).
3. Hjärnan är då blockeras och monterad på en frysning chuck så att vävnad kommer att frysa innan de sektioneras med mikrotomen. Hjärnan är uppställd i en trim läge tills speciella landmärken identifieras, då specifika delar av hjärnan tjocklek, 30 mikrometer i det här fallet, är inställd för hjärnan sektioner som används för analys.
4. Hjärnan delarna är noggrant placerade i brunnar fylls med fosfatbuffert koksaltlösning (PBS), (protokoll för PBS bifogas, observera att detta bara är ett exempel på en standard immuncytokemi protokoll).

3. Immuncytokemi

1. Under de olika stegen i denna process (se bifogat protokoll), är det viktigt att ha exakt pipettering kompetens för att säkerställa exakta mätningar av kemikalier och andra ingredienser viktigt för denna teknik (visa elev pipettering).
2. Det första steget i denna process är att tvätta hjärnan som handlar om att ersätta PBS i brunnen plattorna tre till fem gånger, mellan varje tvätt väl plattorna placeras på en rocker i 10 minuter (visa eleven ersätta PBS och placera brunnar på rockers) .
3. Hjärnan skivor sedan utsätts för den primära antikroppen lösningen och förvaras vid 4 ° C över natten på rocker (visa processen).
4. Efter ytterligare tvätta, är hjärnan skivor utsätts för en sekundär antikropp i en timme på vippan i rumstemperatur, sedan tvättas igen.
5. Nästa hjärnan utsätts för en Avitin-Biotin komplex lösning att förbereda sig för visualisering av neurokemiska-positiva celler.
6. För den slutliga visualisering steget, är hjärnan utsätts för DAB. Detta är en farlig produkt och bör alltid hanteras med försiktighet. Som synes här, hjärnan skivor börjar bli mörkare framför ögonen (visa processen).
7. Efter DAB exponering, hjärnan går igenom den sista serien tvättar och sedan försiktigt placeras på Subbed objektglas och låt dem torka över natten (visar placeringen av en hjärna skiva på en bild, se bilaga för Subbed diabilder protokoll).
8. Bilderna är sedan rensas genom en serie av destillerat vatten och alkohol tvättar, äntligen är begravda i Citrosolv innan coverslipped och lagras i en slidebox för säker förvaring (visar olika aspekter av denna process, se bilaga för clearing-processen).

4. Neuroquantification

1. Efter att bilderna har torkat, kan de bedömas med specialiserade neuroquantification programvara. Här Bioquant programvara används för att kvantifiera vasopressin-positiva celler och fibrer i paraventricular kärnan av musen hjärnor (visa programvara på skärmen ... och mikroskop).
2. Den specifika intresseområde identifieras med hjälp av mätning alternativenav programvaran för att fastställa synfältet för neuroquantification. Det är viktigt att en konsekvent synfält storlek kvantifieras för varje djur (visa eleven göra detta).
3. Här mörkt färgade vasopressin-immunoreaktiva cell organ och fibrer är uppenbara. Eftersom det är svårt att räkna eller spåra denna vävnad, använder en särskild funktion i detta program ljus tröskling att bestämma den totala mängden positivt färgade vävnaden inom det angivna området av intresse. Denna tröskeleffekt berättar hur mycket det angivna området innehöll vasopressin-positiva vävnad (visar datavärde på datorskärmen).

5. Beteendeanalys

1. Om mer än en observatör kommer att göra poäng videoband är det viktigt att etablera inter-rater reliability att säkerställa att observatörer poäng beteendet på ett konsekvent sätt. För den egentliga poäng session bör ett beteende scoring blad vara beredd att möjliggöra enkel poängsättning av beteende under observation sessioner (se tabell 2 för exempel på poängsättning kalkylark).
2. För beteenden som inte är snabba episodisk svar, kan en microsequencing analys avslöjar subtiliteter om utvecklingen av den specifika svar. Till exempel, grooming beteende består av en kedja av mycket snabbt svar. Även om ett alternativ är att helt enkelt spela in förekomsten och varaktigheten av grooming, är en annan att dokumentera händelseförloppet medföljer detta svar. Med denna microsequencing mjukvara, observatörer poäng närvaron av ett visst beteende varje sekund, på uppmaning av programvara (visa mjukvara och video).
3. Efter insamling av data, är de parametrar av intresse fastställas och lämpliga beteendepoäng analyseras. Exempel kan vara total längd tiden i kontakt med valpen, eller antalet störningar i grooming sekvens (visar dator med spridda blad med uppgifter som registreras för varje djur).
4. När beteendet görs är det viktigt att bekräfta att de två arterna uppvisade olika åtgärdsstrategier för uppförande av intresse i studien. I detta fall Kalifornien rådjur möss bör uppvisa mer faderlig beteende än den gemensamma rådjur möss. Dessutom kan olika beteendemässiga åtgärder korrelerad med hjärnan åtgärder för att få en mera komplex bild av relevanta influenser.

6. Representativa resultat:

1. För att validera modellen bör uppgifterna visar tydligt att de två arterna utförs annorlunda med avseende på beteende intresse. Här kan du se att P. californicus män tillbringade mer tid grooming och hukande över valparna, två kännetecken för faderlig svar (se figur 4).
2. För att avgöra om neurobiologial variabeln av intresse är viktigt i faderlig svar, mängden vasopressin (AVP)-positiva vävnad kvantifierades för flera relevanta områden i hjärnan, vilket kan ses, den faderliga P. californicus djuren hade mer immun-positiva vävnaden i flera av dessa områden i hjärnan. (Se Figur 5).
3. I en relaterad studie med microsequencing analysen visade det hypotesen att faderliga Kalifornien möss skulle uppvisa mindre ångest än deras oskuld motsvarigheter, följaktligen, när de utsätts för ett rovdjur lukt, uppvisade fäder färre avbrott i grooming ordning än den jungfruliga djur (se figur 6).

Figur 1: (A) Man Kalifornien möss uppvisar faderlig svar mot conspecific främmande valp. (B) Man rådjur mus uppvisar en försiktig strategi (sträck närvara) och undvikande svar i närvaro av en conspecific främmande valp. Observera: I dessa sociala samspel bedömningar, om en manlig uppvisar aggressiva reaktioner mot valpen, de experimenterar immediately slog toppen av buren för att distrahera den manliga. Vid denna tid sessionen avslutas och valpen tas bort, inspekteras för eventuella skador och återvände till modern. I vårt laboratorium, sällan detta observeras med P. californicus män, men ibland observeras med P. maniculatus, noggrann observation och omedelbart ingripande, dock förhindra skada uppstår för djuren.

Figur 2: Ett Kalifornien mus interagerar med en leksak mus, de flesta försökte att tugga på dessa stimuli.

Figur 3: Experimentell design av studien, fanns det ungefär 6 djur i varje grupp för varje art.

Figur 4: Grafisk av immuncytokemi process.

Figure 5 Paternal svar i Kalifornien och möss rådjur,. mer faderlig svar (brudgummen, huka, snabbare metod) observerades i Kalifornien möss. Mer sträcka deltar (stress) observerades i rådjur möss.

Figur 6. Vasopressin immunreaktivitet inom olika områden i hjärnan på båda arterna. The California möss hade mer färgning i PVN celler och fibrer.

Figur 7: Paternal Kalifornien möss uppvisade färre avbrott i sina grooming sekvenser i närvaro av ett rovdjur lukt än den valp-exponerade och oskuld grupper.

Discussion

I artikeln beskrivs tre viktiga komponenter tros vara avgörande för ett framgångsrikt genomförande av beteendemässiga neurovetenskap undersökningar: (1) en representativ och giltig djurmodell, (2) en noggrann och känslig immuncytokemi protokollet, och (3) de mest analysen (observationsstudier och statistiska ) av både beteende och hjärnan data. Misstag i en enda kategori kommer med största sannolikhet försämra resultatet av hela studien. Därför, efter att noggrant välja ut lämplig djurmodell, bör betydande insatser riktas mot pilotförsök beteendemässiga och histologiska förfaranden för att säkerställa att beteendet säkert kommer att observeras i studien, följt av den framgångsrika behandlingen av hjärnan.

Som tidigare nämnts är användningen av jämförande art att identifiera neurobiologiska mekanismer för en viss reaktion en värdefull metod eftersom denna teknik inte kräver genteknik eller smärtsamma kirurgiska manipulationer. Därför använder denna metod mindre hotad, intakta djur. Användningen av naturliga variationer av djur, dock stärkas genom införlivandet av naturliga-liknande miljöer även om djuren hålls i laboratoriet. Vidare, om laboratoriestudier kan utökas till området för att ytterligare bekräfta äktheten av artskillnader i beteendet av intresse, detta är nästa steg rekommenderas. Även om den komparativa metoden har många fördelar, är en begränsning korrelat typen av uppgifter, därför bör ytterligare tekniker såsom farmakologiska manipulationer användas för att ytterligare validera betydelsen av riktade neurobiologiska system i beteendet av intresse.

När experimentatorerna känner sig säker på beteendemässiga, histologiska och statistiska förfaranden, bör man vara noga så att levnadsvillkoren för djuren vara konstant för alla grupper utom, naturligtvis, för det experimentella manipulation. Förändringar i variabler som ljus scheman, bullernivåer, fastighetsskötare, luftfuktighet och lukt i laboratorium skulle kunna få betydande effekter på djurens neurobiologiska svar.

I den här artikeln den primära antikroppen har använts för detektion av vasopressin men andra primära antikroppar kan användas för en uppsjö av olika neurochemicals av intresse. Om försöksledaren arbetar med en ny antikropp, är det viktigt att genomföra titrering studier för att fastställa den optimala utspädning av den nya antikroppen. Många gånger för mycket antikroppar används (som föreslås av säljaren), vilket resulterar i vävnad som är för mörk för att skilja signalen, ytterligare, är överdriven användning av antikroppen mycket dyrt.

Slutligen, om mer än en statistisk analys kan användas för att ge alternativa synsätt och tolkningar av uppgifter bör de utnyttjas. I denna studie var allmänna linjära modeller, Correlational, och flerdimensionella analyser skalning används för att ge den mest informativa vyer av data.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Binocular Compound Microscope	Motic	BA400
BIOQUANT Life Science Software	BioQuant Image Analysis Corporation	Version 8.40.20
Cryostat	Microm International	HM525
Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump)	Cole-Parmer	7518-00
24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile)	Corning	3526
25x75x1mm Microscope Slides	Globe Scientific, Inc.	1324W
22x50mm No.1 Cover Slip	Globe Scientific, Inc.	1414-10
Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes	Electron Microscopy Sciences	70962-9	&nbps;
Alconox Detergent Powder	Alconox, Inc.	1104
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9888-1kg	CAS 7647-14-5
Monobasic Sodium Phosphate	Spectrum	SO130	CAS 10049-21-5
Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate	Sigma-Aldrich	30412	CAS 10028-24-7
Triton X	Spectrum	TR135	CAS 9002-93-1
Permount	Fisher Scientific	SP15-500	CAS 108-88-3
Chromium potassium Sulfate	Sigma-Aldrich	C-5926	CAS 7788-99-0
CitriSolv	Fisher Scientific	22-143975
Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint	Pharmco-AAPER	111000200CSPP
Normal Goat Serum	Vector Laboratories	S-1000
Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent	Immunostar, Inc.	20069
Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified	Vector Laboratories	BA-1000
Elite Standard Vectastain ABC Kit	Vector Laboratories	PK-6100
DAB Peroxidase Substrate Kit	Vector Laboratories	SK-4100
Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box	Knox		Purchase at local grocery store
3% Hydrogen Peroxide	CareOne		Purchase at local pharmacy
Bleach	Clorox		Purchase at local grocery store