Summary
Karşılaştırmalı tür yaklaşım davranışsal sinirbilimciler, belirli bir hayvan modelinin karakteristik olarak görülmelidir özel davranışları ile ilgili çeşitli nörobiyolojik faktörler keşfetmek için izin verir. Yakından ilgili türler arasındaki davranış farklılıkları doğal olarak meydana gelen yararlanarak, bu tekniği invaziv tekniklerin davranış ifade işlemek için gerekli değildir.
Abstract
Davranışsal sinirbilim bir hedefe belirli davranışlarını düzenleyen altta yatan nörobiyolojik faktörleri tanımlamak. Bu hedefi gerçekleştirmek için hayvan modelleri kullanarak, birçok metodolojik stratejileri ilgi davranış yoğunluğu (örneğin, lezyon yöntemleri, farmakolojik manipülasyonlar, mikrodiyaliz teknikleri, genetik olarak hayvan modellerinde) işlemek için invaziv teknikler gerektirir. Karşılaştırmalı bir tür yaklaşımın kullanımı araştırmacılar, doğal olarak tepki stratejilerini yakından ilgili türlerin mevcut farklılıklar meydana yararlanmanızı sağlar. Laboratuvarda, biz baba tepkileri farklı Peromyscus cins iki tür kullanın. Erkek Kaliforniya geyik fare (Peromyscus californicus), kuzeni ise kadın aynı ebeveyn tepkiler sergiler, ortak geyik fare (Peromyscus maniculatus) yavrular varlığı hemen hemen hiç besleyici / ebeveyn tepkiler sergiler . Bu makalede özel ilgi baba California geyik fare tarafından sergilenen affiliative sosyal tepkiler ile ilişkili nörobiyolojik faktörlerin bir keşif. Davranışsal sinirbilim yaklaşımı çok yönlü olduğundan, çalışmanın aşağıdaki temel bileşenleri kısaca değinilmiş olacak: bu tür araştırma için uygun türlerin tanımlanması, davranış analizi için veri toplama, hazırlama ve beyinleri kesit; için immünsitokimya dahil temel adımlar vazopressin-immünoreaktivite miktarının; beyin dokusu ölçmek için beyin görüntüleme yazılımı kullanımı; microsequencing video analizinin kullanımı, davranış puanı ve, nihayet, uygun istatistiksel analizler, araştırma bulgularının en bilgili yorumlara sağlamak için.
Protocol
1. Hayvan Modeli Tanıtımı
- California Deer Fare (Peromyscus californicus) baba yanıtları keşfetmek için ideal bir model. Gördüğünüz gibi, bu fare, anneler gibi yavrular mamülleri - hatta bu yüzden yavrular bakım gibi görünüyor üzerlerine Crouch. California farelerin davranışlarını sık sık kaçmak ya da onlara saldırmak için çalışırken, yavrular az ilgi gösteren ortak geyik fare (Peromyscus maniculatus) aynı cins, bir tür karşılaştırılır. (Yavrular ile etkileşim bu türlerin resimler için Bkz: Şekil 1).
- Tür modeli tespit edildiğinde, daha sonra çeşitli gruplar oluşturulması gerekmektedir. Bu çalışmada, biyolojik babalar, anne-babalık deneyimi olmayan bakireler, ve her iki türün sınırlı yavru maruz kalma (yavru maruz kalan veya teşvik babalar) ile bakireler yatkın ve edinsel hem de baba özellikleri değerlendirilir, böylece kullanılır. Bu özel çalışmada da sosyal etkileşimler kafes yerleştirilir şey bir yavru ve temsili bir yanıt olduğunu sağlamak için yavru bir oyuncak fare tüm grupların maruz (Bakınız Şekil 2)
- Nörobiyolojik faktörler soruşturma başlamadan önce, seçilen türün ilgi davranış belirgin farklılıklar sergilerler doğrulamak için önemlidir. Bu çalışmada, erkek ile temas yavru harcanan zamanı ve miktarı yaklaşım böyle bir gecikme olarak puan davranışları için kullanılır, beş dakika ve bir baba davranış ethogram (ethogram, örneğin bkz. Tablo 1) bir yavru ile bir kafes yerleştirilir yavru. Agresif tepkiler gözlenmesi halinde, yavru derhal kaldırılır. Bu seanslar genellikle dikkatli bir davranış analizi, daha sonra yapılan böylece videoya.
2. Beyin Dokusu hazırlanması
- Her fare standart perfüzyon (protokol) bağlı, beyinleri özel ilgi alanı (gösteri beyin) kesitli böylece kaldırılır.
- Vazopressin (AVP) - Standart bir farenin beyin atlas (atlas gösterin) hipotalamus paraventriküler çekirdeği, bu çalışmada ilgi nöropeptid üreten hücrelerin zengin olduğu bilinen bir alan bulmak için kullanılır.
- Mikrotom ile kesitli önce doku dondurma böylece beyin daha sonra bloke olur ve donma mandreni monte edilir. Beyin trim modu kesitli sonra, analiz için kullanılan beyin bölümler için belirli beyin kalınlığı, 30 mikron, bu durumda, özel simge tanımlanır kadar.
- Beynin bölümleri dikkatlice fosfat buffer salin (PBS) ile dolu iyi plakaları yerleştirilir; (ekli PBS için protokol, bu sadece bir örnek, standart bir immünsitokimya protokol olduğunu lütfen unutmayın).
3. İmmünositokimya
- (Bkz. ekli protokol), bu sürecin çeşitli adımlar boyunca bu tekniği (öğrenci pipetleme gösterir), kimyasallar ve önemli diğer maddeler hassas ölçümler sağlamak için doğru pipetleme becerilere sahip önemlidir.
- Bu süreçte ilk adım iyi plakaları 3-5 kez PBS yerine içerir beyinleri yıkama; her yıkama arasında iyi bir tabak, 10 dakika boyunca bir rocker yerleştirilen (göstermek yerine öğrenci PBS ve rockçılar iyi plakaları yerleştirerek) .
- Beyin dilimleri sonra primer antikor çözümü maruz kalan ve 4 ° C rocker (gösteri süreci) gece boyunca saklanır.
- Başka bir yıkama sonrasında, beyin dilimleri daha sonra tekrar yıkanır, bir saat boyunca oda sıcaklığında rocker ikincil bir antikor maruz kalmaktadır.
- Sonraki beyin nörokimyasal-pozitif hücrelerin görselleştirme hazırlamak için bir Avitin Biotin Kompleks çözüm maruz kalmaktadır.
- Son görselleştirme adım için, beyinleri DAB maruz kalmaktadır. Bu tehlikeli bir üründür ve her zaman dikkatli bir şekilde ele alınmalıdır. Burada görüldüğü gibi, beyin dilimleri (süreç göstermek) gözleri önünde koyu almak için başlar.
- DAB maruz kalma ardından, beyinlerini yıkar son serisi üzerinden gitmek ve sonra dikkatle Altyazılı mikroskop lamı üzerine yerleştirilen ve bir gecede (slayt üzerinde bir beyin dilim yerleştirme gösterisi; Altyazılı slaytlar protokol için eke bakınız) kurutmak için izin verilir.
- Slaytlar sonra, distile su ve alkol yıkar bir dizi temizlenir, nihayet güvenli tutmak için (bu sürecin çeşitli yönlerini göstermek; temizleme süreci için eke bakınız) slidebox dakika muamele ve depolanan önce Citrosolv batmış.
4. Neuroquantification
- Slaytlar kuruduktan sonra, bu özel neuroquantification yazılım ile değerlendirilebilir. Burada Bioquant yazılım (show ekranda yazılım ... ve mikroskop) fare beyinleri paraventriküler çekirdeğinde vazopressin-pozitif hücre ve lifler ölçmek için kullanılır.
- Ilgi belirli bir alan ölçüm seçenekleri kullanılarak tanımlanıryazılım neuroquantification için görme alanı kurmak için. Tutarlı bir görsel alan boyutu (gösterisi öğrenci Bunu yaparken), her bir hayvan için sayısal olduğunu önemlidir.
- Burada koyu lekeli vazopressin immunoreaktif hücre gövdeleri ve liflerinin açıktır. Bu doku saymak ya da izlemek için zor olduğundan, bu yazılımın bir özelliği belirtilen ilgi alanı içinde olumlu boyanan doku toplam miktarını belirlemek için ışık eşiklendirme kullanır. Bu eşikleme vazopressin pozitif doku (bilgisayar ekranında veri değeri göstermek) içerdiği belirtilen alanın ne kadar söyler.
5. Davranış Analizi
- Birden fazla gözlemci video kasetleri puanlama olacaksa, gözlemciler, tutarlı bir şekilde davranış puanlama olduğunu sağlamak için hakemlerarası güvenilirlik kurmak için önemlidir. Gerçek puanlama oturumu için, bir davranış puanlama formunda (bkz. Tablo 2 tablolama puanlama örneğin) kolay davranış puanlama gözlem oturumları sırasında izin vermek için hazırlıklı olmalısınız.
- Hızlı epizodik yanıtları olmayan davranışlar, bir microsequencing analiz belirli yanıtlar ilerlemesi hakkında inceliklerini ortaya çıkarabilir. Örneğin bakım, davranış, çok hızlı yanıtlar bir zincir oluşur. Bir seçenek damat varlığı ve süresi sadece kayıt olmasına rağmen, başka bir bu yanıtı eşlik eden olaylar zinciri belge. Bu microsequencing yazılımı kullanarak, gözlemciler yazılım (yazılım ve video gösterisi) tarafından istendiğinde belirli bir davranışı, her saniye, varlığı puan.
- Veri toplama, faiz parametreler tespit edilir ve uygun davranış puanları analiz edilmektedir. Örnekler damat dizisi kesintileri (her bir hayvan için girilen verileri tablolama bilgisayar) yavru, ya da numara ile temas halinde harcanan zamanın toplam süresi olabilir.
- Davranış atılırsa sonra bu iki tür için farklı tepki stratejilerinin çalışmaya ilgi davranışı sergiledi onaylamak için önemlidir. Bu durumda California geyik fareler ortak geyik farelere göre daha baba davranışları göstermelidir. Ayrıca, ilgili etkilerin daha bilinçli bir görünüm elde etmek için çeşitli davranış önlemler beyin önlemler ile ilişkili olabilir.
6. Temsilcisi Sonuçlar:
- Modeli doğrulamak için, iki tür faiz davranış bakımından farklı gerçekleştirilen veri açıkça belirtmelidir. Burada gördüğünüz P. californicus erkek yavrular, baba tepkileri iki işaretlerinden (Bakınız Şekil 4) üzerinde bakım ve çömelme daha fazla zaman harcadı.
- Görüleceği gibi, baba P., faiz neurobiologial değişken, baba tepkileri önemlidir vazopressin (AVP) miktarını olumlu doku birkaç ilgili beyin alanları için sayısal belirlemek için californicus hayvanlar, bu beyin bölgelerinin çeşitli daha immün pozitif doku vardı . (Bkz. Şekil 5).
- Microsequencing analizi ile ilgili bir çalışmada, baba Kaliforniya fareler, bakire muadillerine göre daha az anksiyete sergi olacağını hipotezi; buna göre, yırtıcı bir hayvan koku maruz kaldığında, babaları (Şekil damat dizisi bakire hayvanlardan daha az kesinti sergiledi 6).
Şekil 1: (A) conspecific yabancı yavru doğru baba yanıtları sergileyen Bay Kaliforniya fareler. (B) Erkek geyik fare ihtiyatlı bir yaklaşım (esneme katılmak) ve yavru bir conspecific yabancı varlığı kaçınma yanıtını sergiliyor. Not: Bu sosyal etkileşim değerlendirmelerde, bir erkek yavru karşı saldırgan tepkiler sergilemektedir, deneyciler erkek hemen dikkatini dağıtmak için kafesin üstüne vurdu. Şu anda oturum sonlandırılır ve yavru çıkarılır, herhangi bir yaralar için teftiş ve anne geri döndü. Laboratuvarımızda, bu P. ile nadiren görülmektedir californicus erkek ama bazen P. görülmektedir maniculatus yakın gözlem ve acil müdahale, ancak, hayvanların meydana gelen zarar görmesini engellemek.
Şekil 2: oyuncak fare ile etkileşim California fare; en çok bu uyaranlara çiğnemek çalıştı .
Şekil 3: Deneysel çalışma tasarımı; her grupta yaklaşık 6 hayvanlar her tür vardı.
Şekil 4: immünsitokimya süreci Grafik.
Incirure 5 Kaliforniya ve geyik fareler Baba cevaplar; baba tepkileri (damat, çömelme, hızlı bir yaklaşım) Kaliforniya farelerde gözlendi. Streç katılır (stres tepkisi) geyik farelerde gözlendi.
Şekil 6, her iki türün çeşitli beyin bölgelerindeki vazopressin immünoreaktivite. Kaliforniya fareler PVN hücreleri ve elyaf boyama vardı.
Şekil 7: Baba Kaliforniya fareler yavru maruz kalan ve bakir gruplarına göre daha yırtıcı bir hayvan koku varlığında onların tımar dizileri daha az kesintileri sergilenmektedir .
Discussion
Bu makale üç temel bileşenden davranışsal sinirbilim araştırmaların başarılı bir şekilde yürütülmesi için kritik olduğu düşünülen anlatılmaktadır: (2) doğru ve hassas bir immünsitokimya protokol; (1) temsilcisi ve geçerli bir hayvan modeli ve (3) en iyi analiz (gözlemsel ve istatistiksel ) hem de davranış ve beyin veri. Hatalar tek bir kategoride kesinlikle tüm çalışma sonuçları tehlikeye sokacaktır. Bu nedenle, dikkatli bir şekilde uygun hayvan modeli seçtikten sonra, önemli çaba Pilot beyinleri başarılı işleme takip davranış güvenilir çalışma gözlenen olacağını sağlamak için, davranışsal ve histolojik prosedürleri, test doğru olmalıdır.
Bu teknikte, genetik mühendisliği veya ağrılı cerrahi manipülasyonlar gerektirmez, çünkü belirli bir yanıt nörobiyolojik mekanizmaları tanımlamak için karşılaştırmalı türlerinin kullanımı Daha önce de belirtildiği gibi, değerli bir metodolojik yaklaşımdır. Bu nedenle, bu metodolojik bir yaklaşım, daha az tehdit sağlam hayvanlar kullanır. Laboratuar hayvanları içinde yer bile hayvanların doğal varyasyon kullanımı, ancak, doğal-benzeri ortamlarda kuruluş tarafından güçlendirilmiştir. Laboratuvar çalışmaları, daha fazla ilgi davranışı türlerin farklılıkları orijinalliğini doğrulamak için alanına uzatılabilir Dahası, eğer bu bir sonraki adım önerilir. Karşılaştırmalı bir yaklaşım pek çok avantaj sunuyor olsa da, bir sınırlama verilerin bağıntılı doğası; dolayısıyla, farmakolojik manipülasyonları gibi ek teknikler daha fazla ilgi davranış hedeflenen nörobiyolojik sistemler rolü doğrulamak için kullanılan olmalıdır.
Deneyciler, davranışsal, histolojik ve istatistiksel işlemler hakkında güvende hissediyorum sonra, hayvanların yaşam koşullarının tüm gruplar için deneysel manipülasyon için, tabii ki hariç, sabit kalması için alınması gerekmektedir. Işık programları, gürültü seviyeleri, bakıcı, nem seviyeleri ve laboratuvar kokuları gibi değişkenler hayvanların nörobiyolojik tepkiler üzerine önemli etkileri olabilir.
Bu yazıda primer antikor vazopressin ama diğer primer antikorlar farklı ilgi nörokimyasalların bir bolluk için kullanılabilir tespiti için kullanıldı. Deneyci yeni bir antikor ile çalışıyorsa, yeni antikor optimum seyreltme belirlemek için titrasyon çalışmalar yapmak önemlidir. Daha fazla antikor aşırı kullanımı çok pahalı; Birçok kez çok antikor dokuda sinyal ayırt etmek için çok karanlık (satıcı tarafından önerilen) kullanılır.
Sonunda, tek bir istatistiksel analiz daha fazla alternatif görüş ve yorumlara veri sağlamak için kullanılır eğer onlar kullanılan olmalıdır. Bu özel çalışmada, genel doğrusal modeller, bağıntı ve çok boyutlu ölçeklendirme analizi, verilerin en bilgilendirici bir görüş sağlamak için kullanılmıştır.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma herhangi bir hibe tarafından finanse edildi. Ulusal Bilim Vakfı (KGL) 0723341 Ayrıca Schapiro Lisans Araştırma Bursu programı ve Randolph-Macon College Psikoloji Bölümü tarafından sağlanan katkılar için teşekkür ediyoruz. Son olarak, bu video yazı için Ar-MC laboratuvar hazırlanmasında bu araştırma ve Amanda Rzucidlo yardım Craig Kinsley ortak katkıları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Binocular Compound Microscope | Motic | BA400 | |
| BIOQUANT Life Science Software | BioQuant Image Analysis Corporation | Version 8.40.20 | |
| Cryostat | Microm International | HM525 | |
| Masterflex Console Drive Easy-Load L/S (Perfusion Pump) | Cole-Parmer | 7518-00 | |
| 24 Well Cell Culture Cluster (tissue culture treated; non-pyrogenic polystyrene; sterile) | Corning | 3526 | |
| 25x75x1mm Microscope Slides | Globe Scientific, Inc. | 1324W | |
| 22x50mm No.1 Cover Slip | Globe Scientific, Inc. | 1414-10 | |
| Non-sterile 3mL Graduated Large Bulb Transfer Pipettes | Electron Microscopy Sciences | 70962-9 | &nbps; |
| Alconox Detergent Powder | Alconox, Inc. | 1104 | |
| Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S9888-1kg | CAS 7647-14-5 |
| Monobasic Sodium Phosphate | Spectrum | SO130 | CAS 10049-21-5 |
| Sodium Phosphate Dibasic Dihydrate | Sigma-Aldrich | 30412 | CAS 10028-24-7 |
| Triton X | Spectrum | TR135 | CAS 9002-93-1 |
| Permount | Fisher Scientific | SP15-500 | CAS 108-88-3 |
| Chromium potassium Sulfate | Sigma-Aldrich | C-5926 | CAS 7788-99-0 |
| CitriSolv | Fisher Scientific | 22-143975 | |
| Ethanol, High Den.Poly Bottles, 200 proof, 24 x 1 pint | Pharmco-AAPER | 111000200CSPP | |
| Normal Goat Serum | Vector Laboratories | S-1000 | |
| Rabbit anti vasopressin Analyte specific reagent | Immunostar, Inc. | 20069 | |
| Biotinylated anti-rabbit IgG (H+L) affinity-purified | Vector Laboratories | BA-1000 | |
| Elite Standard Vectastain ABC Kit | Vector Laboratories | PK-6100 | |
| DAB Peroxidase Substrate Kit | Vector Laboratories | SK-4100 | |
| Original Unflavored Gelatin (4-count envelopes) 1-oz box | Knox | Purchase at local grocery store | |
| 3% Hydrogen Peroxide | CareOne | Purchase at local pharmacy | |
| Bleach | Clorox | Purchase at local grocery store |
References
- Tada, N., Sato, M., Yamanoi, J., Mizorogi, T., Kasai, K., Ogawa, S. Cryopreservation of mouse spermatozoa in the presence of raffinose and glycerol. J. Reprod. Fertil. 89, 511-516 (1990).
- Yokoyama, M., Akiba, H., Katsuki, M., Nomura, T. Production of normal young following transfer of mouse embryos obtained by in vitro fertilization using cryopreserved spermatozoa. Jikken Dobutsu. 39, 125-128 (1990).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Young, A. F., Mobraaten, L. E. Motility of cryopreserved mouse spermatozoa affected by temperature of collection and rate of thawing. Cryobiology. 35, 46-52 (1997).
- Thornton, C. E., Brown, S. D., Glenister, P. H. Large numbers of mice established by in vitro fertilization with cryopreserved spermatozoa: implications and applications for genetic resource banks, mutagenesis screens, and mouse backcrosses. Mamm. Genome. 10, 987-992 (1999).
- Sztein, J. M., Farley, J. S., Mobraaten, L. E. In vitro fertilization with cryopreserved inbred mouse sperm. Biol. Reprod. 63, 1774-1780 (2000).
- Liu, L., Nutter, L. M., Law, N., McKerlie, C. Sperm freezing and in vitro fertilization in three substrains of C57BL/6 mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 48, 39-43 (2009).
- Nakagata, N. Cryopreservation of mouse spermatozoa and in vitro fertilization. Methods. Mol. Biol. 693, 57-73 (2011).
- Mazur, P., Koshimoto, C. Is intracellular ice formation the cause of death of mouse sperm frozen at high cooling rates. Biol. Reprod. 66, 1485-1490 (2002).
- Jin, B., Yamasaki, C., Yamada, N., Seki, S., Valdez, D. M., Kasai, M., Edashige, K. The mechanism by which mouse spermatozoa are injured during freezing. J. Reprod. Dev. 54, 265-269 (2008).
- Visconti, P. E., Westbrook, V. A., Chertihin, O., Demarco, I., Sleight, S., Diekman, A. B. Novel signaling pathways involved in sperm acquisition of fertilizing capacity. J. Reprod. Immunol. 53, 133-150 (2002).
- Ostermeier, G. C., Wiles, M. V., Farley, J. S., Taft, R. A. Conserving, distributing and managing genetically modified mouse lines by sperm cryopreservation. PLoS ONE. 3, e2792-e2792 (2008).
