Nous démontrons une méthode simple pour placer les cellules à des endroits désirés sur un substrat. Cette méthode schémas cellules en retournant une puce de silicone contenant des micropuits remplis de cellules sur le substrat. Cette méthode offre une nouvelle façon de moduler la signalisation diffusibles et juxtacrine entre les cellules.
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Article de méthode
Modélisation des cellules souches embryonnaires utilisant la puce Bio Retourner
Dans cet article
Résumé
Résumé
Interactions cellule-cellule composée de signalisation diffusibles et contact cellule-cellule (juxtacrine signalisation) sont importants dans de nombreux processus biologiques tels que la croissance tumorale, la différenciation des cellules souches et de cellules souches auto-renouvellement. Un certain nombre de méthodes existent actuellement pour moduler la signalisation cellulaire in vitro. Une méthode de moduler le montant total de la signalisation diffusible est de faire varier la densité de semis de cellules pendant la culture. En raison de la nature aléatoire de l'ensemencement des cellules, cela se traduit par une variation considérable dans la cellule-cellule réelle d'espacement et la quantité de contact cellule-cellule, et ne peut pas prescrire de l'environnement local. Une approche plus spécifique pour la signalisation cellulaire modulant est d'utiliser des inhibiteurs moléculaires ou des approches génétiques pour abattre spécifiques des protéines de signalisation, mais ces deux méthodes sont les mieux adaptés à la manipulation de petits nombres de molécules. Ici, nous démontrons une nouvelle approche de la modulation des cellules de la signalisation cellulaire qui module l'environnement local d'un amas de cellules en plaçant des nombres différents de cellules à des endroits désirés sur un substrat. Cette méthode fournit un moyen complémentaire pour contrôler la signalisation locale diffusibles et juxtacrine entre les cellules. Notre méthode permet l'utilisation de la puce Bio Flip (BFC), une puce de silicone contenant des centaines microfabriqué à des milliers de micropuits, chacun dimensionné pour contenir soit une seule cellule ou un petit nombre de cellules. Nous charger la puce avec des cellules simplement en les pipetage sur le réseau de puits et le lavage des cellules déchargées du tableau. La puce est alors retourné sur un substrat, par lequel les cellules tombent du puits et sur le substrat, le maintien de leur structuration. Après que les cellules ont attaché, la puce peut être retiré (ou à gauche sur). Cette approche de la structuration cellulaire est unique en ce qu'il: 1) ne modifie pas la chimie du substrat, permettant ainsi aux cellules de proliférer et à migrer; 2) permet la structuration sur n'importe quel support, y compris la culture de tissus en polystyrène, verre, matrigel, et même chargeur de couches de cellules, et 3) est compatible avec l'impression par microcontact traditionnelle, permettant la création d'îles de la matrice extracellulaire des cellules placées à l'intérieur des îles. Dans cette vidéo, nous démontrons la structuration des cellules souches embryonnaires de souris sur la culture de tissus en polystyrène en utilisant la CBF.
Protocole
Faire un CBF
BFC sont réalisés par moulage polydiméthylsiloxane (PDMS) sur une 4 "plaquette master silicium.
Faire une plaquette master
- Commencez par déshydratation les plaquettes de Si pendant 30 min à 130 ° C.
- Placer la galette sur un spin-coucheuse, versez SU8-2050 (Microchem) sur la tranche, d'une rampe de 300 rpm / s à 3000-4000 rpm, et de spin pendant 30 s pour obtenir la hauteur caractéristique de 40-30 mm, respectivement.
- Après le filage, placer la galette sur une plaque de cuisson à 65 ° C, immédiatement montée en puissance de la température à 95 ° C pe....
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Discussion
Bien que le protocole et vidéo présentés ici décrivent en utilisant l'une BFC le modèle des cellules souches embryonnaires de souris (mESCs), BFC peuvent être utilisés pour motif de pratiquement n'importe quel type de cellule d'intérêt. Le seul changement on peut avoir besoin de faire est de modifier la taille des micropuits. Dans notre expérience, à utiliser la CBF pour les cellules de modèle unique d'un autre type de cellule, d'un diamètre et la hauteur micropuits égal à 10 microns de diamètre plus grand que.......
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Remerciements
Ce travail a été soutenu par NIH EB007278.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Matrice-mère en silicium | |||
| Plaques de culture tissulaire | Falcon BD | 35-3001 | 35 mm |
| Pinces à levier 3/4" | |||
| PBS | |||
| hexaméthyldisiloxane | Shin-Etsu MicroSi | ||
| Nouvel article | MicroChem Corp. | SU8-2050 | |
| Acétate de PM | |||
| Isopropanol | |||
| BSA | 7,5 % d'albumine sérique bovine |
Références
- Rosenthal, A., Macdonald, A., Voldman, J. Cell Patterning Chip for Controlling the Stem Cell Microenvironment. Biomaterials. 28, 3208-3216 (2007).
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Réimpressions et autorisations
