Summary
Um método para preparar traducionalmente ativa, synaptoneurosomes intacta (SNs) de córtex cerebral de rato é descrito. O método utiliza um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose permitindo a preparação rápida de ativos SNs.
Abstract
Synaptoneurosomes (SNS) são obtidos após homogeneização e fracionamento de rato córtex cerebral. Eles são selados vesículas ou terminais isolados que romper com os terminais do axônio quando o tecido cortical é homogeneizado. Os SNs reter características pré e pós-sináptico, o que os torna útil no estudo da transmissão sináptica. Conservem as máquinas moleculares utilizados na sinalização neuronal e são capazes de captação, armazenamento e liberação de neurotransmissores.
A produção e isolamento de ativos SNs pode ser problemático mídias usando como Ficoll, que podem ser citotóxicos e centrifugação prolongada devido a alta densidade, e filtração e métodos de centrifugação, que pode resultar em baixa atividade, devido a danos mecânicos do SNS. No entanto, o uso de gradientes descontínuos de Percoll-sacarose de densidade para isolar SNs fornece um método rápido para produzir bons rendimentos de SNs traducionalmente ativo. O método do gradiente Percoll-sacarose é rápido e gentil como ele emprega condições isotônica, tem spins centrifugação menos e mais curtos e evita que as etapas de centrifugação pellet SNs e causar danos mecânicos.
Protocol
1. Preparações 1-4
- Prepare 500 mL de tampão de meio de gradiente (GM), misturando 50 mL de uma pasta de sacarose 2,5 M, 2,5 mL de uma 1M Tris-HCl, pH 7,5 valores, e 0,1 mL de um 0,5 m EDTA, pH 8,0 estoque com mili- Q água para volume. Filtro de esterilizar a solução de alíquota, e armazenar congelados.
- Prepare um estoque de 1000x tetrodotoxina (TTX) fazendo uma solução de 1 mM em mili-Q H 2 O. Alíquotas de TTX podem ser armazenadas a -20 ° C.
- Preparar o tampão de Estimulação 10x, fazendo uma solução de 100 mM Tris (pH 7,5), 5 mM Na 2 HPO 4, 4 mM KH 2 PO 4, 40 mM NaHCO 3, e 800 mM NaCl em água milli-Q. Estoque pode ser armazenado a 4 ° C.
- Pré-cool centrífugas a 4 ° C.
- Prepare uma solução estoque de Percoll isosmótica (SIP), adicionando 9 volumes de Percoll (18 mL) para 1 volume de 2,5 M de sacarose (2 mL) em água milli-Q e misture bem.
- Preparar a 3, 10, 15, e camadas gradiente de 23%, adicionando os respectivos montantes de SIP para a GM de buffer e cada mistura:
- Despeje camadas gradiente por pipetagem de 2 ml cada um dos 23, 15, 10, e 3% em soluções de Percoll isosmótica os tubos de centrifugação Beckman com tampas usando um P1000 Gilson Pipetman. A interface entre as camadas devem ser claramente distinguíveis, sem mistura das camadas. Armazenar os gradientes de temperatura de 4 ° C durante pelo menos 20 min antes do uso. Os gradientes podem ser armazenadas por até 24 horas, embora use mesmo dia é recomendado. [Pessoal de laboratório inexperientes podem praticar gradientes preparando adicionando corante azul para as soluções isomotic Percoll para a visualização das interfaces da camada.]
2. Dissecção do mouse uma
- Garantir que todos os criação de mouse e eutanásia procedimentos são realizados de acordo com as diretrizes do NIH e da Universidade. Euthanize filhotes (idade P13 a P21) por asfixia dióxido de carbono ou por um método aprovado no protocolo animal.
- Pin o mouse para uma placa de dissecção e pulverizar a parte de trás do pescoço e da cabeça com etanol. Usando uma tesoura afiada corte através da medula espinhal na base do crânio, retire a pele da parte superior do crânio, corte no crânio lateralmente entre o osso eo osso parietal interparietal ou entre o cérebro e as regiões do córtex. Em seguida, corte no crânio da base para o nariz (ao longo da sutura sagital), remova cuidadosamente o osso parietal macia puxando cada hemisfério para o lado e remover o córtex com uma espátula. Inserir a espátula no cérebro acima do cerebelo e, em seguida, retire o córtex e colocá-lo na gelada tampão GM. Proceder de imediato para a etapa de homogeneização. Não deixe que os córtices sentar na gelada tampão por muito tempo como este irá afectar negativamente a formação de SNs.
3. Preparação de homogenato e SNs 04/01
- Enxágüe os córtices no gelada tampão GM e transferência de dois córtices para um homogeneizador de vidro Dounce contendo 5 mL de tampão GM frio.
- Homogeneizados suavemente os córtices com golpes 10/05 do pilão solto (pilão "A"), seguido por acidentes vasculares cerebrais 10/05 do pilão apertado (pilão "B"). Strokes deve ser rápido, mas lento o suficiente para não causar bolhas de ar. A imagem do homogenato após homogeneização está no Esquema 1. O número de acidentes vasculares cerebrais irá variar consoante a homogeneizador individuais e pilões de acompanhamento. Quando terminar os gradientes deve dar uma banda SN forte, se não, ajustar o número de acidentes vasculares cerebrais.
- Transferir o homogeneizado para a 15 mL cônica e centrifugar a 1000xg por 10 min a 4 ° C em um rotor de caçamba móvel (Allegra 6KR centrífuga) para pellet restos celulares e núcleos. A Imagem do homogeneizado é girado no Esquema 1.
- Layer 2 mL do sobrenadante por Percoll-sacarose gradiente de tampão, os tubos, e centrifugar a 32.500 xg por 5 min a 4 ° C em um rotor de ângulo fixo (Beckman J2-21 centrífuga, JA-17 rotor) o uso de adaptadores apropriados ( ver Reagentes e Equipamentos Tabela).
- Pipeta e descartar a solução acima da banda SN usando um copo Pasteur pipeta. Pipeta off da banda SN na interface 15/23%, transferir para um cone e armazenar no gelo. Cada gradiente ou um córtex produzirá 0,9-1,1 mL de SN.
- Ajustar a concentração de sal do SNS, adicionando um décimo volume de tampão de estimulação 10x, adicione CaCl 1000x 2 a uma concentração final de 12 nM, e adicionar 1 mM de ações TTX a uma concentração final de 1 mM para suprimir a excitação inespecífica. (Adição de CaCl 2 é opcional se ele vai interferir com aplicações a jusante SN).
- Determinar a concentração de proteína do SNs usando o Micro BCA Protein Assay Kit. (O teste de proteína Bradford não é recomendado porque de inferência do Percoll.)
- SNs podem ser usados diretamente e rapidamente para a proteína traduçãoção estudos. Para outras aplicações SN lisado podem ser limpos ou concentrado com o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep.
4. Resultados representativos:
Quando o mouse córtex foi homogeneizado e separados em descontínuo de Percoll-sacarose gradientes (Esquema 1), 6 bandas ou frações foram (Figura 1). Foi mostrado anteriormente para o córtex cerebral de ratos 3,5 que os componentes da alta bandas de peso molecular foram quebrados e membrana de mielina e que o material continha mitocôndrias peletizada ou organelas (Tabela 1). Os 23% interface / 15% (faixa 5) continha os SNs enriquecido.
A banda na interface de 23% / 15%, contendo SNs intacta, foi retirado e examinado por microscopia eletrônica (EM) conforme descrito anteriormente. 2,6 EM mostrou a presença de vesículas sinápticas intacta ea preservação de elementos pré-sináptico e pós-sinápticos (Figura 2). Isolamento de compartimentos pré e pós-sináptica é importante para o exame de sinalização e de síntese de proteína, que ocorre em ambos os compartimentos. 7-13 O gradiente de Percoll-sacarose é um purificação bruto então vimos menor contaminação, celular organela nuclear e na fração de SN, mas o separação geral foi bom.
Quando examinados por Western Blot, as frações Percoll continha os marcadores de proteína com um aumento esperado na pureza sináptica na banda SN (Figura 3, Tabela 2). Marcadores sináptica e neuronal foram mantidos na faixa de SN enriquecido (faixa 5), mas a abundância de outros marcadores foi significativamente reduzida. Em particular, a presença de GFAP, um marcador de células neoplásicas e astrócitos de origem glial, e Lamin-B1, um marcador nuclear, foram insignificantes, enquanto marcadores estruturais e sinápticas foram mantidos ou melhorados. Além disso, houve retenção de marcadores de organelas, como as mitocôndrias e Golgi, que desempenham um papel na síntese protéica.
Rendimentos típicos para a banda SN foram 250-500 ng de proteína por mL, conforme determinado pelo BCA ensaio de proteína. A atividade do SNS foi determinada pela quantidade de síntese protéica de novo presente como monitorados por [35S]-Met incorporação (Figura 4). Basal 2 atividade translacional aumentou 1,56 vezes quando SNs foram estimulados com 50 mM mM glicina glutamate/10 (Glu), ou 5,12 vezes quando ativada com o inibidor juglone Pin1. Inibição Pin1 é conhecido por resultar em aumento da síntese protéica. 2 Para confirmar que o aumento do [35S]-Met incorporação era devido a síntese de proteínas de novo, nós adicionamos 40 anisomicina mM, um inibidor da síntese de proteínas, e viu uma acentuada diminuição na incorporação na presença e ausência de Glu, quando comparado aos níveis basais. Também, mediante a adição de 2% Triton-X 100, o que perturba a integridade dos SNs, tradução basal foi reduzida em 75%. 2 Além disso, ao examinar as bandas (B4-B6), que mostrou o enriquecimento marcador mais sináptica, O SNS ou Banda 5 teve a maior atividade de síntese protéica de novo (Figura 5). Assim, o descontínuo de Percoll-sacarose gradientes rapidamente produzir um altamente ativa e enriquecido banda SN que pode ser usado para estudar a tradução proteica.
O procedimento de gradiente descontínuo de Percoll-sacarose é mais vantajoso do que outros métodos, porque dano mecânico é causado pelas condições mais duras. Quando comparado com o método de filtração, em que apurou homogeneizado cortical é passado através de uma série de filtros que diminuem em tamanho, 3,14-15 o método Percoll formas SNs mais com maior atividade. Como visto na Figura 6, quando uma alíquota de SNs preparados pelo método de filtração foi passada ao longo de um gradiente de Percoll-sacarose há SNs muito menos na interface 15/23% e uma maior quantidade de membranas quebrado. Quando de novo a síntese de proteínas foi medida através S35 met-incorporação, o SNS preparado pelo método de filtração eram muito menos ativa (Figura 7). Para maximizar a atividade translacional usamos ratos que estão entre a idade P14 e P18. SN pode ser preparado a partir de camundongos adultos, mas observamos um aumento significativo de atividade translacional com SN preparados a partir de ratinhos jovens (Figura 8).
Tabela 1. Constituintes das bandas do Percoll descontínuo gradiente de fracionamento do córtex do rato homogeneizado. 3,5
Tabela 2. Resumo da análise de parafuso ocidental de Percoll descontínuo de sacarose-constituintes banda degradê. Concentrações de proteína relativa para cada uma das frações isoladas banda usando um Percol descontínual de sacarose-gradiente foi determinada por Western Blot. Sem proteína presente (-), 0 ≥ 0,2 (+), 0,2 ≥ 0,8 (++), ou> 0,8 vezes (+++) = maior proteína presente no sobrenadante representante (S, centrifugado córtex homogenato), de n 3.
Esquema 1: Esquema de uma preparação SN utilizando um gradiente de densidade descontínua Percoll-sacarose córtex cerebral de camundongos foram dissecados, homogeneizado, e centrifugação a baixa velocidade para remover não-homogeneizado de tecido, células, organelas todo, como núcleos e membranas.. O gradiente descontínuo deve ter camadas bem definidas. A imagem mostra um exemplo de inserção das camadas, que têm sido tingido de azul apenas para fins ilustrativos, a fim de visualizar as camadas. O sobrenadante é camadas em cima de um gradiente de Percoll-sacarose descontínuo e centrifugado a velocidade média. A banda SN é então recuperado do gradiente e está pronto para usar.
Figura 1. Fracionamento homogeneizado em um gradiente Percoll-sacarose descontínua. Córtex do rato foi homogeneizado e separados em um gradiente Percoll-sacarose descontínua dando origem a 6 bandas ou frações. A purificada, ativa SNs (*) foram encontrados na faixa 5.
Figura 2. Preparações SN dar uma mistura heterogênea de SNs que retêm elementos pré-sináptico e pós-sináptica. Uma micrografia eletrônica de uma preparação SN preparados a partir de camundongos C57BL / 6 (idade P13 a P21) foi realizada como descrito anteriormente SNs e shows com preservados elementos pré-sináptico e pós-sináptica. 2 , 6 pontos setas vermelhas para pós-sinápticos densidades. Barra de escala é 1 mícron.
Figura 3. Análises de Western blot de preparações SN mostraram que os marcadores sináptica e neuronal foram mantidas no SNs purificada (Band 5), mas a abundância de outros marcadores foi significativamente reduzida. Immunoblots do sobrenadante (S, centrifugado homogeneizado cortical) e Bandas 1-6 de uma descontínua Percoll-sacarose gradiente foram sondados para β-actina (controle, estruturais de carga), GFAP (astrocitária), GP73 (Golgi), HSC70 (citoplasmática e nuclear), Lamin-B1 (nuclear), Prohibitin (mitocondrial), PSD95 (densidade pós-sináptica ), SNAP25 (sináptica), sinaptofisina (synaptic) e β3-tubulina (neurônio-específica). As bandas foram visualizadas utilizando uma tempestade 860 Phosphorimager, representante de n = 3.
Figura 4. SNs são ativos e apresentam a síntese de proteínas de novo através de [35S]-Met incorporação. SNs foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Em seguida, o SNs foram pré-tratados ou não tratada por 15 min com 40 mM anisomicina ou 1 mM juglone a 37 ° C seguido por adição de [35S]-Met, 20 l expresso Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM.
Figura 5. Banda de 5 a partir do gradiente de Percoll-sacarose descontínua continha os mais altos níveis de síntese protéica de novo. Bandas 4, 5 e 6 e do sobrenadante (S, centrifugado homogeneizado cortical) foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Então, [35S]-Met, expresso Mix Etiqueta Pro S35 Tag Fácil, foi adicionado, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM.
Figura 6. SNs preparados a partir de um método de filtração contêm membranas mais quebrado e SNs menos do que toda SNs preparado a partir do método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose. SNs foram preparadas pela passagem de córtex homogeneizada através de uma série de filtros com a diminuição da dimensão dos poros, como descrito anteriormente. 3,14-15 alíquota Um dos SNs preparados pelo método de filtração foi centrifugado em um gradiente de Percoll-sacarose descontínuo e em comparação com um montante equivalente de material usando o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose.
Figura 7. SNs preparados a partir de um método de filtragem de novo contêm menos proteínas do que atividade de síntese SNs preparado from o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose. SNs foram preparadas pela passagem de córtex homogeneizada através de uma série de filtros com a diminuição da dimensão dos poros, como descrito anteriormente, 3,14-15 e pelos métodos Percoll descontínuo de sacarose-gradiente. SNs de ambas as preparações foram pré-equilibradas a 37 ° C por 10 min. Então, [35S]-Met, expresso Mix Etiqueta Pro S35 Tag Fácil, foi adicionado, mais ou menos Glu a 37 ° C por 30 min. As amostras foram preparadas usando o Pierce SDS-PAGE Sample Kit Prep, executado em um gel de poliacrilamida 15%, secos e quantificado através de um Molecular Dynamics Tempestade 860 phosphorimager, representante de n = 3, ± SEM.
Figura 8. SNs de ratos jovens (P14) têm maior atividade translacional do que os camundongos mais velhos (P85). SNs foram preparados a partir de diferentes ratos idosos usando o método do gradiente descontínuo de Percoll-sacarose, preequilibrated a 37 ° C por 10 min, tratada ou não com Glu na presença de [35S]-Met (Express Etiqueta Pro Mix S35 Tag Fácil) por 30 min, snap congelados, e depois limpou com o Kit Prep Pierce SDS-PAGE da amostra. Os SNs foram executados em um 12% de gel de poliacrilamida SDS, secas e fotografada em uma tempestade Molecular Dynamics 860 phosphorimager representante do n = 3, ± SEM. SNs de P14 camundongos foram pelo menos 3 vezes mais ativo do que P85 camundongos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A preparação de gradiente descontínuo de Percoll-sacarose aqui descrito é um método rápido e confiável para isolar SNs ativo, que pode ser usado em uma variedade de experimentos de transmissão sináptica. Este método do gradiente, que é baseado no método desenvolvido por Dunkley et al., 3,4 é um procedimento de fracionamento subcelular cérebro que isola pré e pós-sináptica da membrana derivada vesículas que estão associados com o outro. Sem purificação adicional esses SNs são compatíveis com uma variedade de técnicas de biologia molecular, incluindo imunoprecipitação, western blotting citometria de fluxo, monitoramento de síntese protéica novo via [35S]-Met incorporação, microscopia eletrônica, e uma variedade de ensaios de atividade enzimática, incluindo isomerase e ensaios de atividade quinase.
O procedimento de gradiente descontínuo de Percoll-sacarose é relativamente simples, no entanto, é fundamental para manter soluções e material cerebral a 4 ° C ao longo da preparação e pré-chill os gradientes. Embora o homogeneizado é mantida gelada em todos os momentos para minimizar a proteólise, por melhores rendimentos com maior atividade é melhor não deixar que o córtex se sentar no gelo em tampão GM muito tempo antes de homogeneização. A formação de SNs é melhor quando o córtex são lavados e depois rapidamente homogeneizada. O homogeneizado, no entanto, podem ser mantidos em gelo antes da centrifugação inicial sem efeitos adversos. Velocidade é um problema uma vez que o córtex foram colhidas, de modo que o isolamento de SNs deve ser concluída o mais rápido possível. Embora SNs podem reter alta atividade por 1-2 horas, períodos prolongados de tempo entre as etapas resultará em diminuição da atividade. A idade dos camundongos utilizados para a preparação SN também é uma questão fundamental. Foi demonstrado anteriormente que existe um declínio relacionado com a idade na plasticidade sináptica em roedores. 16-19 Vimos o mesmo efeito em SNs. Embora os ratos mais velhos podem ser usados para fazer SNs traducionalmente ativa, descobrimos que os ratos jovens (P14) têm maior atividade translacional, em seguida, os ratos mais velhos (P85).
Existem diversas variações e combinações de filtração, centrifugação 5,14-15,20-23, 24-27 e 26-29 gradiente métodos que têm sido usados para preparar SNs e cada um tem suas próprias vantagens e desvantagens. Métodos de filtragem e centrifugação pode causar danos mecânicos ao SNS. Os métodos que têm utilizado diferentes filtros de tamanho dos poros resultou em uma maior porcentagem de membranas quebrado e rendimento SNs significativamente menor. Nós tentamos o método do filtro, 5,14-15 que passa o homogeneizado através de uma série de filtros com a diminuição da dimensão dos poros e descobriu que o SNS preparado pelo método de filtração foram significativamente menos ativos. Os métodos de centrifugação também resultar em danos mecânicos devido à prolongada gira em alta velocidade que pellet ou compactar o SNs na parte inferior de tubos e exigem a ressuspensão. Percoll emprega condições mais brandas que evitam filtragem ou peletização do SNS, que podem esmagar ou lisar as SNs. SN procedimentos que utilizam Ficoll 28,30-32 ou molarities elevado de sacarose 4,31 também resultar em SNs danificado ou menos ativo, comprometimento da função biológica e alterações morfológicas. 31-32 Ficoll pode causar a agregação de células indesejáveis em pH fisiológico e dá gradientes osmóticos com concentrações crescentes. 31-32 Para manter condições isoosmotic, os gradientes de tem que ser compensado com um gradiente de sal. 31 SNs preparada com alta concentração de sacarose (1,4-0,8 M) resultar em SNs menores e menos ativos. 4
O método Percoll-sacarose descontínua supera muitos dos problemas envolvidos com outras mídias e procedimentos de centrifugação. Uma grande vantagem deste método é o uso de Percoll, que tem uma baixa viscosidade, baixa osmolaridade e relativamente sem toxicidade para as células e seus constituintes, tornando-o mais adequado para experimentos gradiente de densidade do que as alternativas. 4,29 Além disso, pode Percoll ser preparado com sacarose para manter a osmolaridade necessários para manter a integridade SN. 4 Usando descontínua Percoll-sacarose gradientes reduz o tempo de centrifugação 30-45 min a 5 min, alargando assim a vida útil do SNS, que têm uma vida limitada para atividade . Outra vantagem dos gradientes de Percoll é o maior rendimento e atividade de SNs quando comparado aos métodos que utilizam filtros para formar SNs. Corremos o SNs do método do filtro ao longo de um gradiente de Percoll-sacarose. Encontramos um mal distinguíveis banda SN e uma abundância de maior peso molecular membranas quebrado no gradiente. Além disso, a atividade de translação da SNs preparados pelo método Percoll foi significativamente maior do que com o método do filtro. No geral, Percoll é preferível a outros métodos, pois emprega condições mais brandas que evitam filtragem e peletização a resultin SNsg em maior retenção de atividade sináptica e formação de melhor vesícula. A vantagem do nosso método mais Dunkley, et al, 3,4 é que um vidro, vidro Dounce homogeneizador foi usado aqui como oposição ao motorizados Teflon, vidro homogeneizador que os danos anexos terminal pós-sináptico e leva mais para os elementos pós-sinápticos serem expostos a a mídia e muito poucos sendo fechados por membranas intactas.
Trabalho significativo tem-se centrado na síntese de proteínas na densidade pós-sináptica 11-13, mas pouco tem sido feito para estudar a síntese de proteínas nos compartimentos pré-sináptica. No entanto, há evidências de que a síntese de proteínas ocorre nos terminais pré-sináptico. 7-10 Como pode ser visto na micrografia eletrônica do SNS, anexos de pré e pós-sináptica existe na preparação SN tornando-os um sistema ideal para o estudo futuro da atividade translacional em ambos os compartimentos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer a BK agosto da Universidade de Wisconsin-Madison Facility Microscópio Eletrônico para a microscopia eletrônica. Este trabalho foi financiado pelo NIH concede R01-DA026067 e P30-HD03352 (a JSM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Micro BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23235 | |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | |
| CO2 gas | Airgas (UW-MDS) | CD 50 | |
| EDTA | RPI | E57020 | |
| EtOH | Fisher | A407SK-4 | |
| HCl | Fisher | A142-212 | |
| Percoll | GE Healthcare | 17-0891-01 | |
| KH2PO4 | Fisher | P285-500 | |
| PierceSDS-PAGE Sample Prep Kit | Pierce | 89888 | |
| NaCl | RPI | S23020 | |
| NaHCO3 | Fisher | BP328-500 | |
| Na2PHO4 | Fisher | S381-500 | |
| Sucrose | RPI | S24060 | |
| Tris Base | RPI | T60040 | |
| Tetrodotoxin | Sigma | T5651 | |
| Express Pro Label Mix S35 Easy Tag | Perkin Elmer | NEG772 | |
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Dissection tools | |||
| Dounce homogenizer, 7 mL (comes with two glass pestles labled " A" and "B") | Wheaton | ||
| P1000 Gilson Pipetman | Gilson | F123602 | |
| Allegra 6KR Centrifuge | Beckman Coulter | 366830 | |
| GH 3.8 Rotor, Swinging bucket rotor | Beckman Coulter | 360581 | |
| Beckman J2-21 Centrifuge | Beckman | ||
| Beckman tubes with caps | Beckman | 355672 | |
| White walled adapters | Beckman | 342327 | |
| Blue walled adapters | Beckman | ||
| JA-17 Rotor, Fixed-angle rotor | Beckman | 369691 | |
Table of antibodies used for western blots: |
|||
| Name of Antibody | Company | Catalogue number | Host Species |
| β-Actin | Sigma | A5441 | mouse |
| GFAP | Santa Cruz | sc-65343 | mouse |
| GP73 | Santa Cruz | Sc-134509 | rabbit |
| HSC70 | Santa Cruz | sc-7298 | mouse |
| Laminβ | Santa Cruz | Sc-6261 | goat |
| Prohibitin | Santa Cruz | sc-28259 | rabbit |
| PSD95 | Millipore | MAB1596 | mouse |
| SNAP25 | AbCam | ab5666-100 | rabbit |
| Synaptophysin | Millipore | MAB368 | mouse |
| β-3-Tubulin | Santa Cruz | sc-80016 | mouse |
|
|||
References
- Westmark, C. J., Malter, J. S. FMRP mediates mGluR5-dependent translation of amyloid precursor protein. PLoS Biol. 5, e52-e52 (2007).
- Westmark, P. R., Westmark, C. J., Wang, S., Levenson, J., O'Riordan, K. J., Burger, C., Malter, J. S. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 3, ra18-ra18 (2010).
- Dunkley, P. R., Heath, J. W., Harrison, S. M., Jarvie, P. E., Glenfield, P. J., Rostas, J. A. A rapid Percoll gradient procedure for isolation of synaptosomes directly from an S1 fraction: Homogeneity and morphology of subcellular fractions. Brain Res. 441, 59-71 (1988).
- Dunkley, P. R., Jarvie, P. E., Robinson, P. J. A rapid Percoll gradient procedure for preparation of synaptosomes. Nat. Protoc. 3, 1718-1728 (2008).
- Hollingsworth, E. B., McNeal, E. T., Burton, J. L., Williams, R. J., Daly, J. W., Creveling, C. R. Biochemical characterization of a filtered synaptoneurosome preparation from guinea pig cerebral cortex: cyclic adenosine 3':5'-monophosphate-generating systems, receptors, and enzymes. J. Neurosci. 5, 2240-2253 (1985).
- Yi, H., Leunissen, J., Shi, G., Gutekunst, C., Hersch, S. A novel procedure for pre-embedding double immunogold-silver labeling at the ultrastructural level. J. Histochem. Cytochem. 49, 279-284 (2001).
- Akins, M. R., Berk-Rauch, H. E., Fallon, J. R. Presynaptic translation: stepping out of the postsynaptic shadow. Front. Neural Circuits. 3, (2009).
- Jin, I., Kandel, E. R., Hawkins, R. D. Whereas short-term facilitation is presynaptic, intermediate-term facilitation involves both presynaptic and postsynaptic protein kinases and protein synthesis. Learn. Mem. 18, 96-102 (2011).
- Lyles, V., Zhao, Y., Martin, K. C. Synapse formation and mRNA localization in cultured Aplysia neurons. Neuron. 49, 349-356 (2006).
- Wagatsuma, A., Azami, S., Sakura, M., Hatakeyama, D., Aonuma, H., Ito, E. De Novo synthesis of CREB in a presynaptic neuron is required for synaptic enhancement involved in memory consolidation. J. Neurosci. Res. 84, 954-9560 (2006).
- Sutton, M. A., Schuman, E. M. Local translational control in dendrites and its role in long-term synaptic plasticity. J. Neurobiol. 64, 116-131 (2005).
- Li, K. -W., Hornshaw, M. P., Van der Schors, R. C., Watson, R., Tate, S., Casetta, B., Jimenez, C. R. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density: implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J. Biol. Chem. 279, 987-1002 (2004).
- Peng, J., Kim, M. J., Cheng, D., Duong, D. M., Gygi, S. P., Sheng, M. Semi-quantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J. Biol. Chem. 279, 21003-21011 (2004).
- Kim, S. H., Fraser, P. E., Westaway, D., St. George-Hyslop, P. H. Group II metabotropic glutamate receptor stimulation triggers production and release of Alzheimer's amyloid β42 from isolated intact nerve terminals. J. Neurosci. 30, 3870-3875 (2010).
- Weiler, I. J., Greenough, W. T. Potassium ion stimulation triggers protein translation in synaptoneurosomal poiyribosomes. Mol. Cell. Neurosci. 2, 305-314 (1993).
- Billard, J. M. Ageing, hippocampal synaptic activity and magnesium. Magnes Res. 19, 199-215 (2006).
- Murphy, G. G., Fedorov, N. B., Giese, K. P., Ohno, M., Friedman, E., Chen, R., Silva, A. J. Increased neuronal excitability, synaptic plasticity, and learning in aged Kvbeta1.1 knockout mice. Curr. Biol. 14, 1907-1915 (2004).
- Norris, C. M., Halpain, S., Foster, T. C. Reversal of Age-Related Alterations in Synaptic Plasticity by Blockade of L-Type Ca21 Channels. J. Neurosci. 18, 3171-3179 (1998).
- Sallert, M., Malkki, H., Segersträlea, M., Tairaa, T., Lauri, S. E. Effects of the kainate receptor agonist ATPA on glutamatergic synaptic transmission and plasticity during early postnatal development. Neuropharm. 52, 1354-1365 (2007).
- Quinlan, E. M., Philpot, B. D., Huganir, R. L., Bear, M. F. Rapid, experience-dependent expression of synaptic NMDA receptors in visual cortex in vivo. Nat. Neurosci. 2, 357-35 (1999).
- Scheetz, A. J., Nairn, A. C., Constantine-Patton, M. NMDA receptor-mediated control of proteins synthesis at developing synapses. Nat. Neurosci. 3, 211-216 (2000).
- Villasana, L. E., Klann, E., Tejada-Simon, M. V. Rapid isolation of synaptoneurosomes and postsynaptic densities from adult mouse hippocampus. J. Neurosci. Methods. 158, 30-36 (2006).
- Weiler, I. J., Greenough, W. T. Metabotropic glutamate receptors trigger postsynaptic protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 7168-7171 (1993).
- Gray, E. G., Whittaker, V. P. The isolation of nerve endings from brain: An electron microscopic study of cell fragments derived by homogenization and centrifugation. J. Anat. 96, 79-88 (1962).
- Gylys, K. H., Fein, J. A., Yang, F., Cole, G. M. Enrichment of Presynaptic and Postsynaptic Markers by Size-Based Gating Analysis of Synaptosome Preparations From Rat and Human Cortex. Cytometry A. 60, 90-96 (2004).
- Hajós, F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity. Brain Res. 93, 485-489 (1975).
- Bai, F., Witzmann, F. A. Synaptosome Proteomics. Subcell. Biochem. 43, 77-98 (2007).
- Rao, A., Steward, O. Evidence that protein constituents of postsynaptic membrane specializations are locally synthesized: analysis of proteins synthesized within synaptosomes. J Neurosci. 11, 2881-2895 (1991).
- Pertoft, H., Laurent, T. C. Isopycnic separation of cells and cell organelles by centrifugation and modified colloidal silica gradients. Methods of Cell Separation. Catsimpoolas, N. , Plenum Press. New York. 25-65 (1977).
- Ramarao, C. S., Acharya, S. R., Krishnan, K. S., Kenkare, U. W. High affinity uptake of L-glutamate and γ-aminobutyric acid in Drosophila melanogaster. J. Biosci. 11, 119-135 (1987).
- Munteanu, L. S., Dinu, A. Fractionation of granulocytes from whole human blood by centrifugation. Practical hints. Romanian J. Biophys. 14, 53-58 (2004).
- Cell separation composition, kit and method. US patent. Vlasselaer, P., Van Palathumpat, V. , 019713 (1997).
