Summary
Dit is een methode om leukocyt adhesie te visualiseren aan het endotheel in geoogste drukvaten. De techniek maakt het bestuderen van vasculaire adhesie onder afschuiving stroom met verschillende intraluminale druk tot 200 mmHg aldus de pathofysiologische omstandigheden van hoge bloeddruk na te bootsen-ing.
Abstract
Wereldwijd, hypertensie is naar verluidt in ongeveer een kwart van de bevolking en is de toonaangevende biomedische risicofactor voor mortaliteit wereldwijd. In het vaatstelsel hypertensie wordt geassocieerd met endotheliale dysfunctie en verhoogde ontsteking leidt tot atherosclerose en diverse ziektebeelden zoals chronische nierziekte 2, beroertes 3 en hartfalen 4. Een eerste stap in het vasculaire ontsteking leidt tot de atherogenese is de hechting cascade die de rollen, tethering, naleving en de daaropvolgende transmigratie van leukocyten door het endotheel inhoudt. Werving en accumulatie van leukocyten aan het endotheel wordt bemiddeld door een opregulatie van adhesie moleculen zoals vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellulaire cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) en E-selectine en toename van de cytokine en chemokine vrijkomen en een opregulatie van reactieve zuurstof species 5. In vitro-methoden zoals statische hechting testen helpen om mechanismen die betrokken zijn in cel-cel adhesie, alsook de analyse van celadhesie-moleculen te bepalen. Methoden die in eerdere in vitro studies hebben aangetoond dat acute stijging van de druk op het endotheel kan leiden tot monocyten hechting, een opregulatie van adhesiemoleculen en inflammatoire markers 6 echter, vergelijkbaar met een groot aantal in vitro-testen, deze bevindingen zijn niet uitgevoerd in real-time onder fysiologische omstandigheden stroom, noch met volbloed. Daarom worden in vivo testen steeds meer gebruikt in diermodellen om vasculaire ontsteking en plaque ontwikkeling aan te tonen. Intravitale microscopie is nu op grote schaal gebruikt om de leukocyten adhesie, walsen, migratie en transmigratie 7-9 te beoordelen. Bij het combineren van de effecten van de druk op de leukocyten aan endotheel adhesie van de in vivo studies zijn minder uitgebreid. Een van deze studie onderzoekt de real-time effecten van de flow en afschuiving op arteriële groei en remodeling, maar inflammatoire markers werden alleen beoordeeld via immunohistochemie 10. Hier presenteren we een model voor het opnemen van leukocyten adhesie in real time in intacte onder druk bloedvaten met behulp van volbloed perfusie. De methodiek is een wijziging van een ex vivo schip kamer perfusie model 9, die real-time analyse van leukocyt-endotheliale lijm interacties in intacte schepen mogelijk maakt. Onze aanpassing maakt de manipulatie van de intraluminale druk tot 200 mmHg waardoor studeren niet alleen onder fysiologische stroming, maar ook druk omstandigheden. Terwijl de druk myography systemen zijn eerder aangetoond dat vaatwand en lumen diameter 11 en schip krimp zien is dit de eerste keer tonen leukocyten-endotheel interacties in real time. Hier laten we zien de techniek met behulp van halsslagaders geoogst van ratten en gecanuleerde om een custom-made stroom kamer gekoppeld aan een fluorescentiemicroscoop. Het schip kamer is uitgerust met een groot dekglaasje bodem waardoor een grote diameter objectief met een korte werkafstand om de afbeelding van het schip. Bovendien kunnen geselecteerde agonist en / of antagonisten worden gebruikt om verder te onderzoeken van de mechanismen die celadhesie. Voordelen van deze methode meer dan intravitale microscopie zijn geen betrokkenheid van invasieve chirurgie en dus een hogere doorvoersnelheid kan worden verkregen. Deze methode maakt het ook mogelijk het gebruik van gelokaliseerde remmer behandeling om de gewenste schip terwijl intravitale alleen mogelijk systemische remmer behandeling.
Protocol
1. Isoleren van halsslagaders
- Euthanase10 week oud Sprague Dawley ratten via CO 2 / O 2 stikken.
- Accijnzen links en rechts gemeenschappelijke halsslagaders met aorta en het hart zorgen voor een minimale rek van de schepen.
- In ijskoud Krebs buffer gescheiden van de halsslagaders van de aorta en het hart en uit te voeren dicht dissectie.
- Houden geïsoleerde schepen in Krebs op het ijs voor de montage.
Ca. tijd = 45 min.
2. Priming van het schip kamer
- Op de proximale en distale aansluitingen van het schip kamer flush Krebs buffer gehandhaafd op fysiologische pH door het inbrengen van carbogen gas (95% O 2, 5% CO 2) door de buffer bij 37 ° C.
- Zorg ervoor dat slangen en canules zijn volledig gespoeld en worden uitgelijnd.
- Spoel Krebs buffer door de P1 (proximale) en P2 (distale) transducers. Dicht kranen geen luchtbellen in de transducers te verzekeren.
- Sluit de sensoren aan de overeenkomstige connectors en weer spoelen meer Krebs buffer zodat er geen luchtbellen. Af te sluiten kranen naar de kamer.
Ca. tijd = 15 minuten
3. Onder druk van het schip kamer
- Zet drukapparatuur: druk servo, druk monitor, peristaltische pomp (figuur 1).
- Met de peristaltische pomp op druk en de druk servo op de automatische lopen Krebs buffer via de slang bij 20 mmHg (dial op 1), zodat er geen luchtbellen.
- Sluit de slang aan de gesloten P2 transducer. Druk zal worden stabiel.
- Open P2 tik op om het schip kamer uit te spoelen eventuele luchtbellen vervolgens af te sluiten.
- Vul het bad met Krebs buffer (5 - 7 ml).
Ca. tijd = 10 minuten
4. Montage van het schip
- Onder een dissectiemicroscoop plek zwart polyester banden op elke canule (figuur 2).
- Uit elkaar bewegen canules en canule houders en montage ¼ vat (aortaboog einde) op de P1 canule. Zorg ervoor dat niet aan het schip scheuren.
- Met behulp van een injectiespuit gevuld met Krebs buffer zachtjes spoelen overtollige bloed uit het vat via P1 transducer. Af te sluiten P1 naar kamer.
- Veilig vaartuig naar de P1 canule met de polyester stropdas.
- Bewegen canules / canule houders dichter voor montage op de P2 canule.
- Mount distale uiteinde van het schip (~ ¼ van de lengte) op distale canule. Veilig met polyester stropdas.
Ca. tijd = 20 minuten
5. Onder druk van het schip
- Stel de canule houders geen gebogen of gevouwen in de tank te verzekeren.
- Met P1 en P2 gesloten om de kamer schakel de druk servo van automatisch naar handmatig. Controle van de druk servo is er geen continue daling van de druk binnen de 10 seconden. Als er is, is een lek optreedt en de verbindingen en transducers moeten worden vastgezet.
- Terug Stel de druk servo om automatisch open P2 aan de kamer. Onder de microscoop te observeren het schip verwijden wanneer de kraan wordt geopend naar de kamer.
- Schakel de druk servo naar handmatig. Nogmaals te controleren op continue daling van de druk binnen de 10 seconden. Als er een lek dan is het systeem niet strak druk en er is waarschijnlijk een gat in het vat te zijn.
- Terugschakelen naar automatisch te openen P1 naar de kamer. Op de handmatige instelling te controleren dat de druk stabiel blijft.
- Als er geen lekken, op handmatige instelling te verhogen draaiknop om 2 (40 mmHg).
- Aan te passen aan de automatische en bekijk de vaartuigen die onder de microscoop. Indien nodig, de canule houder geen bocht in de vessel.Check op lekkage op de handmatige instelling te garanderen.
- Herhaal de stappen 5,6 tot 5,7 het verhogen van de draaiknop om drie (60 mmHg), 4 (80 mmHg) en zo verder tot de gewenste druk is bereikt.
Ca. tijd = 15 - 30 minuten
6. Het incuberen van de onder druk staande schip
- Sluit de temperatuurregelaar ingesteld op 37 ° C.
- Met een tweede peristaltische pomp perfuseren Krebs buffer (1 ml / min) in het vat kamer bad.
- Sluit aspirator naar kamer garanderen alleen de bovenste laag van het bad wordt verwijderd.
- Incubeer druk vat bij 37 ° C gedurende 1 uur met de druk is ingesteld op automatisch.
- Controleer de druk is niet lekt (te schakelen naar manuele) periodiek.
- De effecten van verschillende farmacologische interventies kunnen worden waargenomen door simpelweg toevoegen van de verbinding om het bad tijdens de incubatie.
Ca. tijd = 1 uur
7. Perfuseren de onder druk staande schip met volbloed
- Tijdens de incubatie te krijgen op zijn minst 7,5 ml humaan volbloed / vaartuig verzameld in 40 U heparine / ml bloed. Incubeer in een 50 ml falcon bij 37 ° C.
- 10 minuten voor het einde van de thij incubatie label bloed met VybrantDil (1:1000) gedurende 10 minuten bij 37 ° C in het donker.
- Na 10 minuten, het verzamelen van bloed in een spuit clearing eventuele luchtbellen en bevestig op een spuit pomp met een warmte-jasje ingesteld op 37 ° C.
- Af te sluiten P1 transducer naar de kamer / vaartuig en sluit spuit en afval buizen.
- Purge bloed bij 1000 pL / min door het afval slangetje om het even welke bellen te verwijderen.
- Open P1 naar de kamer. De druk servo zal automatisch aanpassen aan de gewenste druk te handhaven.
- Perfuseren bloed bij 100 pL / min.
- Met behulp van een fluorescerende microscoop gekoppeld aan een digitale camera verslag twee velden van de geperfuseerde schip gedurende 15 seconden op 1, 3, 5, 7,5 en 10 minuten.
- Na de perfusie endotheel integriteit en functie kan worden beoordeeld via farmacologische technieken zoals myograph en adhesiemoleculen expressie kan worden bepaald door immunohistochemie om verder te valideren de ontstekingsreactie.
Ca. tijd = 15 minuten
8. Representatieve resultaten:
Een schematisch diagram van de drukkamer setup is weergegeven in figuur 1. Met een digitale camera gekoppeld aan een fluorescentiemicroscoop resultaten kunnen direct worden gevisualiseerd via live video-opnames. Vertegenwoordiger van videobeelden zijn te zien in figuur 3, waar leukocyten worden beschouwd als aanhanger van het endotheel als ze bleven stil voor 10 seconden. Met de video-opnamen op een continue lus gehandeld cellen kan worden beschouwd als een gemiddelde per veld. Hoewel beide laag (figuur 3A) en hoge (figuur 3B) druk zal een bepaalde hoeveelheid van de hechting leiden tot een significante toename van leukocyten adhesie op het hogere intraluminale druk wordt gezien en dit is ook kwantitatief aangetoond (figuur 4).
Figuur 1. Onder druk ex vivo schip kamer schema. Gecanuleerde Een vat aangesloten op een proximaal (P1) transducer en een distale (P2) transducers die de bloeddruk kan worden gemanipuleerd in het vat. Perfusie is door de P1 transducer en de druk wordt onderhouden via P2 transducer.
Figuur 2. Cannuala met banden. Zwarte polyester banden zijn aan elke canule.
Figuur 3. Vertegenwoordiger van videobeelden. Dynamic cel adhesie (rode pijl) onder fluorescentie bij 80 mm Hg (A) en 120 mmHg (B) na 10 minuten van de perfusie.
Figuur 4. Leukocyt hechting in Sprague Dawley halsslagaders na 1 uur incubatie bij lage (80 mmHg) en hoge druk (120 mmHg). *** P <0.001, zoals geanalyseerd door de 2-weg herhaalde metingen ANOVA met Bonferroni post hoc test.
Discussion
Dit is een aangepaste methode om leukocyt adhesie studeren aan het endotheel in intacte geïsoleerde bloedvaten onder druk omstandigheden in real time. Perfusie van het schip kamer alleen al maakt een snelle validatie van pro-inflammatoire stammen van de grote muizen en ratten schepen. Waardoor de druk manipulatie laat dynamische cel interacties in acht te nemen van laag tot zeer hoog intraluminale druk, dus beter na te bootsen-ing fysiologische en pathofysiologische omstandigheden. Diameter van de schepen kan ook worden gemeten met behulp van een voldoende cell-imaging-programma, zodat shear flow en snelheid kan worden bepaald en dus gemanipuleerd.
Met zijn myograph mogelijkheden, farmacologische interventies in het bad nog een dimensie toe aan de experimentele omstandigheden mogelijk met dit model mogelijk studies van de mechanistische en signaalwegen. Terwijl endotheel bewaring kan niet worden bevestigd tijdens de druk van manipulatie, kunnen reacties op ACh en PE worden uitgevoerd na de perfusie 9.
Opgemerkt moet worden dat deze opzet de effecten van de intraluminale druk op de cel-tot-cel interacties niet de effecten van de pulsatiele bloedstroom, noch systolische of diastolische druk toont. Bovendien, terwijl de druk acute veranderingen op leukocyt adhesie werden waargenomen, kan deze setup ook worden gebruikt om te kijken naar chronische druk-effecten (namelijk het vergroten incubatietijden en het gebruik van een chronische druk diermodel). Sprague Dawley gemeenschappelijke halsslagaders worden gedemonstreerd in deze set-up maar ook andere stammen en diersoorten kunnen worden gebruikt met de nodige aanpassingen aan de canule maat. Inderdaad, is het belangrijk op te merken dat de leeftijd en het gewicht van de dieren grootte van het vaartuig van invloed zijn en dus dat de set-up moet worden geïndividualiseerd voor elk vaartuig. Sluiten en een zorgvuldige dissectie van het bindweefsel kan verbeteren visualisatie van leukocyten enorm.
Disclosures
Het studieprotocol werd goedgekeurd door de Alfred Medical Research en Onderwijs Precinct Dier Ethische Commissie en het Alfred Hospital ethische commissie.
Acknowledgments
Dit onderzoek werd mede ondersteund door OIS de Victoriaanse regering Program, de National Health en Medical Research Council van Australië programma en projectsubsidies (JPF Chin-Afstoffen) en de postdoctorale beurs (D Michell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
