Summary
זוהי שיטה לדמיין הידבקות ליקוציט כדי האנדותל של כלי בלחץ שנקטפו. הטכניקה מאפשרת ללמוד הידבקות כלי דם תחת זרם גזירה עם לחצים שונים intraluminal עד 200 מ"מ כספית ובכך לחקות-ing התנאים pathophysiological של לחץ דם גבוה.
Abstract
יתר לחץ דם ברחבי העולם, היא דיווחה כי ברבעון כ האוכלוסייה הוא הגורם המוביל ביו הסיכון עבור תמותה ברחבי העולם. ב יתר לחץ דם בכלי הדם קשורה בתפקוד האנדותל דלקת מוגברת המובילה טרשת עורקים מדינות מחלה שונים, כגון מחלת כליות כרונית 2, 3 שבץ ואי ספיקת לב 4. הצעד הראשוני דלקת בכלי הדם המובילים atherogenesis הוא מפל הידבקות שכרוך מתגלגל, קשירה, הדבקות ואת גלגול מאוחר של לויקוציטים דרך האנדותל. גיוס הצטברות של לויקוציטים כדי האנדותל הוא מתווך על ידי הגברת הביטוי של מולקולות הדבקה כגון הידבקות התא וסקולרית מולקולה-1 (VCAM-1), הדבקה תא תאיים מולקולה-1 (ICAM-1) ו-E-selectin וכן עליות ציטוקינים ו chemokine לשחרר upregulation של מינים החמצן מגיב 5. In vitro שיטות כגון מבחני הידבקות סטטי לעזור לקבוע מנגנונים מעורבים התא אל התא הדבקה כמו גם ניתוח של מולקולות הידבקות התא. שיטות המועסקים הקודם במבחנה הראו עליות חדות הלחץ על האנדותל יכול להוביל הידבקות מונוציטים, upregulation של מולקולות הדבקה ו סמנים דלקתיים 6 עם זאת, דומה הרבה מבחני חוץ גופית, ממצאים אלה לא בוצעו בזמן אמת בתנאים זרימה פיזיולוגיות, וגם עם דם כולו. לכן, מבחני vivo מנוצלים ויותר במודלים של בעלי חיים כדי להדגים דלקת בכלי הדם והתפתחות פלאק. מיקרוסקופיה Intravital כיום בשימוש נרחב על מנת להעריך הידבקות לויקוציטים, הגירה מתגלגל, גלגול 7-9. כאשר המשלב את ההשפעות של הלחץ על ליקוציט הידבקות אנדותל במחקרים vivo הן נרחבות. מחקר אחד כזה בוחן את ההשפעות בזמן אמת של זרימה גזירה על צמיחת עורקים סמנים דלקתיים שיפוץ אך הוערכו רק באמצעות אימונוהיסטוכימיה 10. כאן אנו מציגים מודל הקלטה הידבקות ליקוציט בזמן אמת ללא פגע כלי דם בלחץ הדם באמצעות זלוף כולו. המתודולוגיה היא שינוי של מודל קאמרית לשעבר vivo זלוף 9 כלי המאפשר ניתוח בזמן אמת של לויקוציטים-אנדותל האינטראקציות דבק בכלי ללא פגע. שינוי שלנו מאפשר מניפולציה של הלחץ intraluminal עד 200 מ"מ כספית ומאפשר ללמוד לא רק בתנאים זרימה פיזיולוגיות אלא גם בתנאי לחץ. בעוד myography מערכות הלחץ הוכחו בעבר לצפות קיר לומן כלי בקוטר 11 כמו גם התכווצות כלי זה הוא הפעם הראשונה הוכחת ליקוציט-אנדותל האינטראקציות בזמן אמת. כאן אנו להדגים את הטכניקה באמצעות עורקי הראש שנקטפו מן חולדות cannulated לתא מחוייט זרימה מצמידים את מיקרוסקופ פלואורסצנטי. החדר כלי מצויד coverglass תחתית גדול המאפשר עדשה בקוטר גדול אובייקטיבי עם מרחק עבודה קצר לתמונה כלי. יתר על כן, אגוניסט נבחרים ו / או היריבים יכול להיות מנוצל כדי להמשיך לחקור את מנגנוני השליטה הידבקות התא. היתרונות של שיטה זו על פני מיקרוסקופיה intravital כוללים שום מעורבות של ניתוח פולשני ולכן התפוקה גבוהה יותר ניתן להשיג. שיטה זו גם מאפשרת את השימוש של טיפול מעכב מקומי לכלי הרצוי ואילו intravital רק מאפשר טיפול מעכב מערכתי.
Protocol
1. בידוד עורקי הראש
- Euthanase10 בן שבוע ספראג Dawley חולדות דרך ה-CO 2 / O 2 מחנק.
- והבלו עורקי התרדמה על ימין ועל שמאל משותפת עם אבי העורקים והלב הבטחת מתיחה מינימלי של הכלים.
- ב חיץ קרח קרבס קר להפריד את עורקי הראש של אבי העורקים והלב ולבצע דיסקציה קרוב.
- שמור על כלי מבודד קרבס על הקרח לפני הרכבה.
כ. זמן = 45 דקות
2. תחול הקאמרית כלי
- בשלב המחברים הפרוקסימלית ומ דיסטלי של החיץ קאמרית כלי קרבס סומק שמרו ב-pH הפיזיולוגי על ידי יציקת גז carbogen (95% O 2, 5% CO 2) דרך למאגר ב 37 ° C.
- ודא צינורות cannulas סמוקות לגמרי מיושרים.
- פלאש חיץ Kreb דרך P1 (פרוקסימלי) ו P2 (דיסטלי) מתמרים. הברזים סגור כדי להבטיח שאין בועות אוויר מתמרים.
- חבר את מתמרים למחברים המתאימים ושוב סומק יותר חיץ קרבס הבטחת אין בועות אוויר. סגור את הברזים לחדר.
כ. זמן = 15 דקות
3. Pressurizing הקאמרית כלי
- הפעל את ציוד הלחץ: הלחץ סרוו, לפקח על לחץ, משאבת peristaltic (איור 1).
- עם המשאבה peristaltic על הלחץ סרוו הלחץ על חיץ אוטומטי קרבס לרוץ דרך צינורות ב 20 מ"מ כספית (חיוג ב 1), הבטחת אין בועות אוויר.
- חיבור צינורות כדי מתמר P2 סגור. הלחץ יהיה יציב.
- פתח ברז P2 לתא כלי לשטוף את כל הבועות ואז לסגור.
- מלאו את האמבט עם קרבס חיץ (5-7 מ"ל).
כ. זמן = 10 דקות
4. הרכבה כלי
- במקום לנתח תחת מיקרוסקופ קשרים פוליאסטר שחור על גבי כל צינורית (איור 2).
- העבר cannulas ובעלי צינורית בנפרד הר ¼ כלי (סוף קשת אבי העורקים) על גבי הצינורית P1. ודא שלא לקרוע את כלי הדם.
- באמצעות מזרק מלא קרבס חיץ בעדינות סומק עודף דם מתוך כלי השיט באמצעות מתמר P1. סגור את P1 לתא.
- כלי מאובטחת על צינורית P1 עם העניבה פוליאסטר.
- העבר cannulas / מחזיקי הצינורית יותר להרכבה על צינורית P2.
- סוף הר דיסטלי של כלי השיט (~ ¼ אורך) על הצינורית הדיסטלית. מאובטח עם עניבה פוליאסטר.
כ. זמן = 20 דקות
5. Pressurizing כלי
- התאם את מחזיקי הצינורית כדי להבטיח שאין לכופף או למתוח את הספינה.
- עם P1 ו-P2 סגור לחדר להחליף את שרת הלחץ אוטומטית ידנית. בדוק את הלחץ על סרוו אין ירידה מתמדת בלחץ תוך 10 שניות. אם יש, דליפת מתרחש ואת הקשרים מתמרים צריך להיות מאובטח במקום.
- התאם את סרוו הלחץ חזרה P2 לפתוח אז אוטומטית לתא. תחת המיקרוסקופ לצפות כלי להתרחב כאשר הברז נפתח לחדר.
- כבה את סרוו לחץ ידני. שוב לבדוק ירידה מתמדת בלחץ תוך 10 שניות. אם יש נזילה אז המערכת לא לחץ חזק שם צפוי להיות חור הכלי.
- עבור בחזרה ל P1 לפתוח אוטומטית לתא. על הגדרה ידנית לבדוק שהלחץ נשאר יציב.
- אם אין דליפה, על הגדרת חיוג ידני להגדיל ל 2 (40 מ"מ כספית).
- התאם אוטומטית ולבחון את כלי מתחת למיקרוסקופ. במידת הצורך, להתאים את בעל צינורית כדי להבטיח שום עיקול vessel.Check על הדלפות על הגדרה ידנית.
- חזור על שלבים 5.6-5.7 הגדלת חיוג ל 3 (60 מ"מ כספית), 4 (80 מ"מ כספית) וכך הלאה, עד הלחץ הרצוי הוא הגיע.
כ. זמן = 15-30 דקות
6. דוגרים כלי בלחץ
- חבר את בקר הטמפרטורה מוגדר 37 ° C.
- עם שני peristaltic משאבת perfuse קרבס חיץ (1 mL / min) לאמבטיה קאמרית כלי.
- חבר aspirator לתא להבטיח רק את השכבה העליונה של האמבט מוסר.
- דגירה כלי בלחץ על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 עם הלחץ מוגדר אוטומטית.
- בדוק הלחץ לא דולף (מעבר ידני) מעת לעת.
- ההשפעות של התערבויות פרמקולוגיות שונות ניתן לראות פשוט על ידי הוספת תרכובת לאמבטיה במהלך הדגירה.
כ. זמן = 1 שעה
7. המרוססת כלי בלחץ דם שלם
- במהלך הדגירה להשיג לפחות 7.5 מ"ל דם כל אדם / כלי שנאספו הפרין U 40 / מ"ל דם. דגירה של 50 מ"ל בז ב 37 ° C.
- 10 דקות לפני תום tהוא תווית הדגירה דם עם VybrantDil (1:1000) במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחושך.
- לאחר 10 דקות, לאסוף דם מזרק ניקוי כל הבועות ולצרף על משאבת מזרק עם ז'קט חום נקבע על 37 ° C.
- סגור את מתמר P1 לחדר / כלי ולהתחבר מזרק צינורות פסולת.
- טהר דם μL 1000 / min דרך צינורות הפסולת כדי להסיר כל הבועות.
- פתח P1 לחדר. סרוו לחץ תתאים באופן אוטומטי כדי לשמור על הלחץ הרצוי.
- Perfuse דם μL 100 / min.
- באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצמידים להקליט מצלמה דיגיטלית שני שדות של כלי perfused למשך 15 שניות ב 1, 3, 5, 7.5 ו - 10 דקות.
- זלוף הודעה תקינות תפקוד האנדותל ניתן להעריך באמצעות שיטות פרמקולוגיים כגון myograph ו מולקולה ביטוי הדבקה ניתן לקבוע באמצעות אימונוהיסטוכימיה להמשיך לאמת את התגובה הדלקתית.
כ. זמן = 15 דקות
8. נציג תוצאות:
תרשים סכמטי של תא הלחץ ההתקנה מוצג באיור 1. עם מצלמה דיגיטלית מצמידים את תוצאות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ניתן דמיינו מיידי באמצעות הקלטות וידאו חי. נציג תמונות וידאו נראים באיור 3 שבו leukocytes נחשבים חסיד אל האנדותל אם יישארו נייחים במשך 10 שניות. עם הקלטות וידאו על תאים לולאה רציפה דבק ניתן לספור כשדה הממוצעת. אמנם הן נמוכות (איור 3A) גבוה (איור 3 ב) הלחץ יגרום מידה מסוימת של הידבקות עלייה משמעותית הידבקות ליקוציט בלחץ גבוה intraluminal נתפסת וזה הוכיח גם כמותית (איור 4).
באיור 1. Pressurised כלי לשעבר vivo סכמטית קאמרית. כלי cannulated מחובר מתמר (P1) הפרוקסימלית ו דיסטלי (P2) מתמרים המאפשרת את לחץ הדם כדי לטפל בתוך הכלי. זלוף היא באמצעות מתמר P1 והלחץ נשמר באמצעות מתמר P2.
איור 2. Cannuala עם קשרים. הקשרים פוליאסטר שחור מחוברים צינורית כל אחד.
איור 3. תמונות וידאו נציג. הידבקות התא דינמי (חץ אדום) תחת הקרינה ב 80 מ"מ כספית (א) ו - 120 מ"מ כספית (ב) לאחר 10 דקות של טפטוף.
איור 4. הדבקה ליקוציט ב ספראג Dawley הראש העורקים לאחר דגירה 1 שעה בשפל (80 מ"מ כספית) ו בלחץ גבוה (120 מ"מ כספית). *** P <0.001, נותחו על ידי 2-way ANOVA אמצעים חזר באמצעות מבחן Bonferroni פוסט הוק.
Discussion
זוהי שיטה שונה ללמוד הידבקות ליקוציט כדי האנדותל של כלי הדם ללא פגע מבודד בתנאים בלחץ בזמן אמת. זלוף של החדר כלי לבד מאפשר אימות מהירה של הפרו דלקתי זנים של עכברים גדולים וכלי חולדה. מניפולציה הפעלת הלחץ מאפשר אינטראקציות תא דינמי לצפות נמוך מ ללחצים intraluminal גבוהה מאוד, ולכן עדיף לחקות-ing פיזיולוגיים תנאי pathophysiological. קוטר כלי ניתן למדוד באמצעות תוכנית מספיק תאים הדמיה תזרים גזירה ולכן וקצב ניתן לקבוע מניפולציות לכן.
עם יכולות myograph שלה, התערבות פרמקולוגית להציב באמבטיה להוסיף מימד נוסף של תנאי הניסוי אפשרי עם המודל הזה מאפשר מחקרים של מסלולים מכניסטית איתות. בעוד שימור האנדותל לא ניתן לאשר במהלך מניפולציה לחץ, התגובות ACH ו-PE יכול להתנהל זלוף הודעה 9.
יצויין כי התקנה זו ממחישה את ההשפעות של הלחץ intraluminal על התא אל התא אינטראקציות לא את ההשפעות של זרימת הדם הסיסטולי pulsatile ולא לחצים או הדיאסטולי. יתר על כן, בעוד שינויים בלחץ חריפה על הידבקות ליקוציט נצפו, ההתקנה זה יכול להיות מנוצל גם להסתכל על ההשפעות לחץ כרוני (כלומר הגדלת פעמים הדגירה באמצעות מודל כרוני בבעלי חיים בלחץ). ספראג העורקים Dawley הראש הנפוצים הם הפגינו להגדיר זאת אך זנים ומינים אחרים ניתן להשתמש עם התאמות מתאימות לגודל צינורית. ואכן, חשוב לציין כי גיל ומשקל של החיות להשפיע על גודל הספינה ובכך להגדיר את זה למעלה צריך להיות אינדיבידואלי עבור כל ספינה. דיסקציה סגור וזהיר של הרקמה החיבורית יכול לשפר להדמיה של לויקוציטים מאוד.
Disclosures
פרוטוקול המחקר אושר על ידי ההסתדרות הרפואית אלפרד מחקר וחינוך בעלי התחנה ועדת האתיקה ובית החולים אלפרד ועדת האתיקה.
Acknowledgments
מחקר זה נתמך בחלקו על ידי תוכנית של ממשלת ויקטוריאני OIS, הבריאות הלאומי המועצה למחקר רפואי מענקים אוסטרליה תוכנית הפרויקט (JPF הסנטר טלק) וכן מלגה לתואר שני (ד מישל).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
