Summary
Questo è un metodo per visualizzare l'adesione dei leucociti all'endotelio in raccolte serbatoi in pressione. La tecnica consente di studiare l'adesione vascolare in condizioni di flusso di taglio con differenti pressioni intraluminali fino a 200 mmHg così imitare-zione le condizioni fisiopatologiche di alta pressione sanguigna.
Abstract
In tutto il mondo, l'ipertensione è segnalato per essere in circa un quarto della popolazione ed è il fattore principale di rischio biomedici per la mortalità a livello mondiale. Nella ipertensione vascolare è associata a disfunzione endoteliale e l'infiammazione che porta a una maggiore aterosclerosi e patologie diverse come la malattia renale cronica 2, 3, ictus e scompenso cardiaco 4. Un primo passo nel processo infiammatorio vascolari che determinano l'aterogenesi è la cascata di adesione che prevede la laminazione, tethering, aderenza e conseguente trasmigrazione dei leucociti attraverso l'endotelio. Reclutamento e l'accumulo dei leucociti all'endotelio è mediata da un sovraregolazione delle molecole di adesione come la molecola di adesione delle cellule vascolari-1 (VCAM-1), l'adesione cellulare molecola intracellulare-1 (ICAM-1) ed E-selectina così come gli aumenti in rilascio di citochine e chemochine e una sovraregolazione di specie reattive dell'ossigeno 5. Metodi in vitro come test adesione statica aiutare a determinare i meccanismi coinvolti nella cellula-cellula l'adesione, nonché l'analisi delle molecole di adesione delle cellule. Metodi utilizzati in precedenti studi in vitro hanno dimostrato che un aumento acuto della pressione sul endotelio può portare ad adesione dei monociti, un sovraregolazione di molecole di adesione e marker infiammatori 6 Tuttavia, simile a molti test in vitro, questi risultati non sono stati eseguiti in tempo reale in condizioni di flusso fisiologico, né con sangue intero. Pertanto, in vivo sono sempre più utilizzati in modelli animali per dimostrare l'infiammazione vascolare e lo sviluppo della placca. Microscopia intravitale è ora ampiamente utilizzato per valutare l'adesione dei leucociti, lamiere, migrazione e trasmigrazione 7-9. Quando si combinano gli effetti della pressione sui leucociti per l'adesione endoteliale studi in vivo sono meno estese. Uno di questi studi prende in esame gli effetti in tempo reale del flusso di taglio e sulla crescita arteriosa e marker infiammatori rimodellamento, ma sono stati valutati solo attraverso immunoistochimica 10. Qui vi presentiamo un modello per la registrazione di adesione dei leucociti in tempo reale intatta vasi sanguigni sotto pressione, utilizzando la perfusione di sangue intero. La metodologia è una modifica di un modello di nave ex camera di perfusione in vivo 9 che permette analisi in tempo reale delle interazioni leucociti-endotelio adesivo in vasi intatte. La nostra modifica consente la manipolazione della pressione intraluminale fino a 200 mmHg consentendo lo studio non solo in condizioni di flusso fisiologico ma anche condizioni di pressione. Mentre i sistemi myography pressione sono state precedentemente dimostrato di osservare nave parete e lume diametro 11 così come la contrazione nave questa è la prima volta dimostrando leucociti-endotelio interazioni in tempo reale. Qui mostriamo la tecnica utilizzando carotidi raccolti da ratti e cannulata ad una misura camera di flusso accoppiato ad un microscopio a fluorescenza. La camera di imbarcazione è equipaggiata con il coprioggetti fondo permettendo una grande lente di grande diametro obiettivo a breve distanza di lavoro per l'immagine della nave. Inoltre, agonista selezionati e / o antagonisti può essere utilizzata per approfondire i meccanismi che controllano l'adesione cellulare. I vantaggi di questo metodo rispetto microscopia intravitale includono alcun coinvolgimento di un intervento chirurgico invasivo e quindi un throughput più elevato può essere ottenuto. Questo metodo consente anche l'utilizzo di inibitori della localizzato l'imbarcazione desiderata mentre intravitale consente solo trattamento sistemico inibitore.
Protocol
1. Isolando le arterie carotidee
- Euthanase10 settimana di vita ratti Sprague Dawley via di CO 2 / O 2 asfissia.
- Accise arterie comuni a sinistra ea destra della carotide con aorta e il cuore garantendo allungamento minimo dei vasi.
- Nel buffer di ghiaccio freddo Krebs separare le arterie della carotide e dell'aorta dal cuore e di eseguire la dissezione chiudere.
- Mantenere i vasi isolati in Krebs sul ghiaccio prima del montaggio.
Ca. tempo = 45 minuti
2. Priming la nave da camera
- Al connettori prossimale e distale del buffer nave camera filo Krebs mantenuta a pH fisiologico infondendo CarboGen gas (95% O 2, 5% CO 2) attraverso il buffer a 37 ° C.
- Garantire tubi e cannule sono lavata completamente e sono allineati.
- Flush del buffer Kreb attraverso il P1 (prossimale) e P2 (distale) trasduttori. Chiudere i rubinetti per assicurarsi che non bolle d'aria nel trasduttori.
- Collegare i trasduttori ai connettori corrispondenti e ancora di più a livello di buffer di Krebs garantendo l'assenza di bolle d'aria. Chiudere i rubinetti alla camera.
Ca. tempo = 15 min
3. Pressurizzazione della camera di nave
- Accendere attrezzature a pressione: servo di pressione, controllo della pressione, pompa peristaltica (Figura 1).
- Con la pompa peristaltica sulla pressione e il servo di pressione in automatico tampone Krebs correre attraverso il tubo a 20 mmHg (quadrante a 1), garantendo l'assenza di bolle d'aria.
- Collegare il tubo al trasduttore P2 chiuso. Pressione diventerà stabile.
- Aprire il rubinetto P2 alla camera nave per scovare eventuali bolle poi chiudere.
- Riempire il bagno con tampone Krebs (5 - 7 mL).
Ca. tempo = 10 minuti
4. Montaggio della nave
- Sotto un microscopio a dissezione legami poliestere posto nero su ogni cannula (Figura 2).
- Spostare cannule e titolari cannula a parte e montare nave ¼ (arco aortico fine) sulla cannula P1. Garantire a non strappare la nave.
- Utilizzando una siringa piena di Krebs tampone delicatamente lavare il sangue in eccesso della nave tramite trasduttore P1. Chiudere P1 a camera.
- Nave sicuro alla cannula P1 con la cravatta di poliestere.
- Spostare cannule / titolari cannula più vicino per il montaggio su la cannula P2.
- Monte fine distale del vaso (~ ¼ della lunghezza) sulla cannula distale. Fissare con cravatta poliestere.
Ca. tempo = 20 minuti
5. Pressurizzazione della nave
- Regolare i titolari cannula per garantire che non piegare o tirare in vaso.
- Con P1 e P2 chiuso alla camera di cambiare il servo di pressione da automatico a manuale. Controllare il servo di pressione non è costante riduzione della pressione entro 10 secondi. Se c'è, si sta verificando una perdita e le connessioni e trasduttori devono essere fissati al suolo.
- Regolare il servo pressione a automatica P2 quindi aprire alla camera. Al microscopio osservare la nave si dilatano quando il rubinetto è aperto alla camera.
- Accendere il servo pressione manuale. Anche in questo caso verificare la costante riduzione della pressione entro 10 secondi. Se c'è una perdita allora il sistema non è a tenuta di pressione e non ci sarà probabilmente un buco nel serbatoio.
- Tornare alla automatica P1 aperto alla camera. L'impostazione manuale verificare che la pressione rimane stabile.
- Se nessuna perdita, in linea manuale aumentare l'impostazione di 2 (40 mmHg).
- Regolare in automatico e osservare la nave sotto il microscopio. Se necessario, regolare il titolare cannula per assicurarsi che non piegare in vessel.Check per perdite su impostazione manuale.
- Ripetere i passaggi 5,6-5,7 aumentando il selettore per 3 (60 mmHg), 4 (80 mmHg) e così via fino a quando la pressione desiderata.
Ca. tempo = 15 - 30 minuti
6. Incubando la nave sotto pressione
- Collegare il set di controllo della temperatura a 37 ° C.
- Con una seconda pompa peristaltica profumato tampone Krebs (1 ml / min) nel bagno della camera nave.
- Collegare aspiratore alla camera garantire solo lo strato superiore del bagno è stato rimosso.
- Incubare nave pressurizzata a 37 ° C per 1 ora con la pressione impostato su Automatico.
- Controllare la pressione non perde (il passaggio a manuale) periodicamente.
- Gli effetti dei vari interventi farmacologici possono osservare semplicemente aggiungendo il composto al bagno durante l'incubazione.
Ca. tempo = 1 ora
7. Perfusione del vaso pressurizzato con sangue intero
- Durante l'incubazione ottenere almeno 7,5 ml di sangue intero / nave raccolti in 40 eparina U / ml di sangue. Incubare in un falco da 50 ml a 37 ° C.
- 10 minuti prima della fine del tsi etichetta sangue incubazione con VybrantDil (1:1000) per 10 minuti a 37 ° C al buio.
- Dopo 10 minuti, raccogliere il sangue in una siringa di compensazione eventuali bolle e attaccare su una pompa a siringa con una giacca di calore a 37 ° C.
- Chiudere trasduttore P1 alla camera / navi e collegare la siringa e tubo di scarico.
- Sangue purga a 1000 ml / min attraverso il tubo di scarico per rimuovere eventuali bolle.
- Aprire P1 alla camera. Il servo di pressione si regola automaticamente per mantenere la pressione desiderata.
- Perfusione di sangue a 100 l / min.
- Utilizzando un microscopio a fluorescenza accoppiato ad una fotocamera digitale registrare due campi della nave perfusi per 15 secondi a 1, 3, 5, 7,5 e 10 minuti.
- Perfusione Messaggio integrità e la funzione endoteliale può essere valutata mediante tecniche farmacologiche come miografo molecola di espressione e di adesione può essere determinato mediante immunoistochimica per validare ulteriormente la risposta infiammatoria.
Ca. tempo = 15 min
8. Rappresentante dei risultati:
Un diagramma schematico della configurazione camera di pressione è mostrata in Figura 1. Con una fotocamera digitale accoppiato ad un microscopio a fluorescenza risultati possono essere visualizzati immediatamente tramite registrazioni video in diretta. Immagini video rappresentativi sono visto in Figura 3, dove sono considerati leucociti per essere aderente al endotelio se è rimasto fermo per 10 secondi. Con le registrazioni video sulle cellule ciclo continuo aderito può essere contato come un campo medio per. Mentre sia basso (Figura 3A) e alta (Figura 3B) pressione causerà una certa quantità di adesione un aumento significativo l'adesione dei leucociti con la pressione più alta intraluminale è visto e questo è anche dimostrato quantitativamente (Figura 4).
Figura 1. Pressurizzato ex vivo camera schematica nave. Una nave cannulata collegato ad una prossimale (P1) e di un trasduttore distale (P2), trasduttori di pressione del sangue che permette di essere manipolati all'interno della nave. Perfusione è attraverso il trasduttore di P1 e la pressione viene mantenuta tramite trasduttore P2.
Figura 2. Cannuala con legami. Cravatte in poliestere nero sono collegati a ciascun cannula.
Figura 3. Immagini video rappresentativo. Adesione cellulare dinamico (freccia rossa) con fluorescenza a 80 mmHg (A) e 120 mmHg (B) dopo 10 minuti di perfusione.
Figura 4. Adesione dei leucociti in Sprague Dawley arterie carotidi dopo 1 ore di incubazione a basse (80 mmHg) e ad alta pressione (120 mmHg). *** P <0,001, come analizzato da 2-way ANOVA a misure ripetute utilizzando il test post hoc di Bonferroni.
Discussion
Si tratta di un metodo modificato per studiare l'adesione dei leucociti all'endotelio in intatti i vasi sanguigni isolato in condizioni di pressione in tempo reale. Perfusione della camera solo recipiente consente una rapida convalida dei pro-infiammatorie ceppi di topi e grandi vasi di ratto. L'attivazione consente la manipolazione di pressione dinamica delle interazioni delle cellule che devono essere osservati dal basso verso l'intraluminale pressioni molto elevate, quindi meglio imitare-mento fisiologico e condizioni fisiopatologiche. Diametro dei vasi può essere misurata con un sufficiente cellulare imaging programma e quindi il flusso di taglio e la velocità può essere determinato e quindi manipolata.
Con le sue capacità miografo, interventi farmacologici nel bagno aggiungere un'altra dimensione alle condizioni sperimentali possibile con questo modello che permette studi meccanicistici e dei percorsi di segnalazione. Mentre la conservazione endoteliali non può essere confermata durante la manipolazione di pressione, le risposte a ACh e PE può essere condotta perfusione post 9.
Va notato che questa impostazione dimostra gli effetti della pressione intraluminale sulla cellula-cellula non interazioni gli effetti del flusso ematico pulsatile né sistolica o diastolica. Inoltre, mentre le variazioni di pressione acuta sulla adesione dei leucociti sono stati osservati, questa configurazione può essere utilizzata anche per guardare gli effetti della pressione cronica (cioè aumentando i tempi di incubazione e utilizzando un modello animale cronico di pressione). Sprague Dawley arterie carotidi comuni sono dimostrate in questo set up, ma altri ceppi e le specie possono essere utilizzati con gli opportuni adeguamenti alle dimensioni cannula. Infatti, è importante notare che l'età e il peso degli animali sulle dimensioni del vaso e quindi che il set up deve essere personalizzato per ciascuna nave. Dissezione stretta e attenta del tessuto connettivo in grado di migliorare la visualizzazione dei leucociti immensamente.
Disclosures
Il protocollo dello studio è stato approvato dal Medical Alfred Ricerca e l'Educazione degli animali Precinct Comitato Etico e l'Alfred Hospital Comitato Etico.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto in parte dal Programma OIS del Governo del Victoria, il National Health and Medical Research Council of Australia borse di programmi e progetti (JPF Chin-spolverare) e borsa di studio post-laurea (D Michell).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
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