Summary
これは収穫加圧された血管の内皮への白血球の接着を可視化する方法です。テクニックは、このように高血圧の病態生理学的条件を模倣 - イング200 mmHgに管内の圧力に異なるとのせん断流動下で血管の密着性を研究することができます。
Abstract
世界中で、高血圧は、人口の約4分の1であることが報告と死亡率、世界中の主要な生物医学的危険因子です。血管性高血圧では血管内皮機能障害とアテローム性動脈硬化症や慢性腎臓病2、脳卒中3心不全4など様々な疾病状態につながる増加炎症に関連付けられています。アテローム発生につながる血管の炎症の初期段階では、内皮を介して白血球のローリング、テザリング、アドヒアランスやその後の転生を含む接着カスケードです。内皮への白血球の動員と蓄積は、血管細胞接着分子-1（VCAM - 1）、細胞内の細胞接着分子-1（ICAM - 1）とE -セレクチンと同様の増加などの接着分子の発現増加によって媒介されるサイトカインとケモカイン放出と活性酸素種のアップレギュレーション5。このような静的な接着アッセイなどのin vitro法では細胞間接着に関与するメカニズムだけでなく、細胞接着分子の解析を判断するのに役立ちます。 in vitro試験前で採用されている手法は、内皮上に圧力の急性の増加が単球接着、6しかし、in vitro試験の多くと同様に、これらの結果がリアルタイムで行われていない接着分子と炎症マーカーの発現上昇につながることができることが実証されている生理的流れの条件下で、また全血を持つ。したがって、in vivo試験では 、ますます血管炎症とプラークの開発を実証するために動物モデルで利用されています。生体顕微鏡検査は現在では広く白血球接着、ローリング、マイグレーションと転生7-9を評価するために使用されます。 in vivo試験内皮接着する白血球に圧力の効果を組み合わせるときには、それほど広範です。そのような研究は、免疫組織化学10を介して評価された動脈の成長とリモデリングが炎症マーカーのフローとせん断のリアルタイムエフェクトを調べます。ここでは、全血灌流を使用して無傷の加圧された血管のリアルタイムで白血球の接着を記録するためのモデルを提示する。方法論は、無傷の血管の白血球-内皮接着剤の相互作用のリアルタイム解析を可能にするex vivoの血管室灌流モデル9の変更です。私たちの修正は、管腔内圧だけでなく、生理的な流れの条件だけでなく、加圧条件下での試験を可能にする最大200 mmHgの操作が可能になります。圧力の筋運動記録法のシステムが以前に血管壁と内腔直径11だけでなく、血管の収縮を観察することが立証されているが、これはリアルタイムで白血球-内皮相互作用を示す初めてのことです。ここでは、頸動脈ラットから採取し、蛍光顕微鏡に結合カスタムメイドのフローチャンバーへのカニューレを使用して技術を実証する。容器のチャンバーは、画像の容器を、短い作動距離と大口径対物レンズを可能にする大規模な底のカバーガラスが装備されています。さらに、選択されたアゴニストおよび/またはアンタゴニストは、さらに細胞接着を制御するメカニズムを調べるために利用することができます。生体顕微鏡に比べてこの方法の利点は、侵襲手術のない関与を含んでいないため、より高いスループットを得ることができます。生体内では唯一の全身阻害剤の治療を可能にするのに対し、この方法はまた、所望の容器にローカライズされた阻害剤の治療を使用できるようになります。
Protocol
1。頸動脈を分離
- CO 2 / O 2窒息経由Euthanase10週齢のSprague Dawleyラット。
- 最小限の血管の伸縮性を確保大動脈、心臓と消費税の左と右の総頸動脈。
- 氷冷クレブス緩衝液中で大動脈と心臓から頚動脈を分離し、緊密な解剖を行う。
- マウントする前に氷上でクレブスで孤立した血管を保つ。
約。時間= 45分
2。プライミング容器室
- 37バッファを介し℃、carbogenガス（5％CO 2 95％O 2）を導入することで、生理的pHに維持血管チャンバーフラッシュクレブスバッファーの近位および遠位のコネクタで
- チューブやカニューレが完全にフラッシュされると、整列されていることを確認します。
- P1（近位）とP2（遠位）変換器を介してクレブスバッファーをフラッシュします。トランスデューサには、気泡のないことを確認するためにタップを閉じます。
- 対応するコネクタにトランスデューサを接続し、再び空気の泡を確実にない、よりクレブスバッファーをフラッシュします。チャンバーにタップをオフに閉じてください。
約。時間= 15分
3。血管の加圧室
- 圧力機器の電源をオンにします。圧力サーボ、圧力モニター、蠕動ポンプ（図1）。
- 圧力は20 mmHgの（1のダイヤル）でチューブを介して自動実行クレブス緩衝液の圧力のサーボで蠕動ポンプと、空気の泡を保証しません。
- 閉じたP2トランスデューサにチューブを接続します。圧力が安定になります。
- どんな泡を吐き出すのに血管チャンバーにP2のタップを開くには、その後オフ閉じます。
- クレブスバッファー（ - 7 mLの5）と風呂を埋める。
約。時間= 10分
4。容器の取り付け
- 各カニューレ上に解剖顕微鏡の代わりに黒のポリエステルネクタイ（図2）に基づく。
- 離れてカニューレとカニューレホルダーを移動して、P1のカニューレ上にマウント¼容器（大動脈弓の端）。容器を引き裂くしないことを確認します。
- クレブス緩衝液で満たされた注射器を使用すると、静かにP1のトランスデューサーを介して血管の過剰な血液を洗い流す。チャンバーにP1をオフに閉じます。
- ポリエステルのネクタイとP1のカニューレに安全な容器。
- P2カニューレに取り付けるためのカニューレ/近いカニューレホルダーを移動します。
- 遠位カニューレに容器の先端を（〜¼長さの）マウントします。ポリエステルタイで固定します。
約。時間= 20分
5。容器を加圧
- 容器内に曲げたり、ストレッチを確保しないようにカニューレホルダーを調整します。
- P1とP2は、チャンバーに閉じた状態で自動から手動に圧力サーボを切り替えます。 10秒内の圧力の継続的な低下が存在しない圧力のサーボを確認してください。ある場合は、リークが発生している接続と変換器は、所定位置に固定する必要があります。
- チャンバーへの自動その後オープンP2に背圧サーボを調整します。顕微鏡下でタップをチャンバーに開いたときに血管が拡張させ観察。
- マニュアルに圧力のサーボを切り替えます。 10秒内の圧力の継続的な低下のためにもう一度確認してください。漏れがある場合、システムはタイトな圧力と容器内の穴になる可能性がありますされていません。
- チャンバーに自動オープンP1に切り替えます。手動設定で圧力が安定していることを確認してください。
- ない漏れの場合、手動設定の増加ダイヤルの2（40 mmHgの）へ。
- 自動に調整し、顕微鏡下で血管を観察。必要に応じて、手動設定に漏れがないvessel.Checkには曲がりのないことを確認するためカニューレホルダーを調整する。
- 5.7所望の圧力に到達するまでに、3（60 mmHgの）を4（80 mmHgの）などのダイヤルを増やす - 手順5.6を繰り返します。
約。時間= 15〜30分
6。加圧容器をインキュベート
- 37温度コントローラセットを接続℃を
- 血管室バスへの2番目の蠕動ポンプ散らすクレブス緩衝液（1 mL /分）で。
- バスの唯一の最上位層が除去されることを保証室にアスピレータを接続します。
- 自動に設定された圧力で1時間、37℃で加圧された容器をインキュベートする。
- 圧力が定期的に（手動への切り替え）漏洩されていません確認してください。
- 様々な薬理学的介入の効果は、単にインキュベーション中にお風呂に化合物を添加することによって観察することができます。
約。時間= 1時間
7。全血と加圧容器を灌流
- インキュベーション中に少なくとも7.5 mLのヒト全血/ 40 Uのヘパリン/ mLの血液中に収集された容器を得る。 37℃で50mlファルコンでインキュベート℃の
- tの最後の10分前37彼10分間VybrantDil（1:1000）とインキュベーションのラベルの血·ダークのC。
- 10分後、気泡をクリアシリンジで血液を収集し、37℃で設定されたヒートジャケット℃でシリンジポンプに取り付けて
- 室/容器にP1のトランスデューサをオフに閉じ、シリンジと廃液チューブを接続する。
- 任意の気泡を除去するため廃液チューブを介して1000μL/ minでパージの血液。
- チャンバーにP1を開きます。圧力のサーボは、所望の圧力を維持するために自動的に調整されます。
- 100μL/ minの血液を灌流。
- デジタルカメラのレコード1で15秒間灌流血管の2つのフィールド、3、5、7.5および10分に結合蛍光顕微鏡を使用する。
- 郵便灌流血管内皮の完全性と機能がさらに炎症反応を検証するために免疫組織化学によって決定することができるようミオグラフと接着分子の発現などの薬理学的技術を介して評価することができる。
約。時間= 15分
8。代表的な結果：
圧力室のセットアップの概略図を図1に示されています。と蛍光顕微鏡の結果に結合デジタルカメラは、ライブビデオの録画を経由して瞬時に視覚化することができます。代表的なビデオ画像は、白血球が、彼 らが10秒間静止残った場合内皮に付着すると考えられる図3に見られている。連続ループ接着細胞でのビデオ録画とフィールド当たりの平均としてカウントすることができます。低い（ 図3A）と高い（ 図3B）圧力の両方に密着性のある量の高い管腔内圧における白血球接着の顕著な増加を引き起こすだろうが見られ、これはまた、（ 図4）定量的に実証される。
図1。加圧ex vivoでの血管チャンバー概略図。近（P1）変換器と血圧が容器内で操作できるようにする、遠位（P2）変換器に接続されているカニューレ容器。灌流は、P1のトランスデューサーを介して、圧力はP2変換器を介して維持されます。
図2。タイでCannuala。黒いポリエステルのネクタイは、各カニューレに接続されています。
図3。灌流の10分後の代表的なビデオ画像を 80 mmHgの（）で蛍光下。ダイナミック細胞接着（赤矢印）、120 mmHgの（B）。
図4。低い（80 mmHgの）と高圧（120 mmHgの）で1時間のインキュベーション後のSprague Dawleyラット頸動脈の動脈における白血球接着。 *** P <0.001、としてBonferroniの事後検定を用いて2方向反復測定ANOVAで分析した。
Discussion
これはリアルタイムで加圧条件下では無傷の孤立した血管の内皮への白血球の接着を研究するために修正された方法です。容器室の血流だけでは、大規模なマウスやラットの血管の炎症誘発性菌株の迅速な検証が可能になります。圧力操作を有効にすると、より良い模倣- ING生理学的および病態生理学的状態、動的な細胞間相互作用が非常に高い腔内圧力に低いから観察することができます。血管の直径は、十分な細胞イメージングプログラムを使用して測定することができるため、せん断流れおよび速度を決定し、したがって、操作することができます。
そのミオグラフ機能により、浴室に置かれた薬理学的介入は、このモデルは機械論的とシグナル伝達経路の研究を可能にすると可能な実験条件に別のディメンションを追加します。内皮保存が圧力の操作中に確認することはできませんが、アセチルコリンとPEへの応答がポスト灌流9を行うことができる。
それは、このセットアップは、細胞間の相互作用ではない拍動血流も収縮期または拡張期圧の影響についての管腔内圧の影響を示すことに注意する必要があります。白血球接着に対する急性圧力の変化が観察された一方さらに、、この設定はまた、慢性的な圧力の効果（すなわちインキュベーション時間の増加と慢性的な圧力の動物モデルを用いて）を見に利用することができます。のSprague Dawleyラット総頚動脈は、このセットにまで実証されていますが、他の系統と種は、カニューレのサイズに適切な調整で使用することができます。確かに、動物の年齢と体重がセットアップ船舶ごとに個別化する必要があることをこのように容器のサイズに影響を与えるとことに注意することが重要です。結合組織の密接かつ慎重に解剖は非常に白血球の可視化を向上させることができます。
Disclosures
治験実施計画書は、アルフレッド医学研究と教育分署動物倫理委員会とアルフレッド病院倫理委員会によって承認された。
Acknowledgments
この研究は、ビクトリア州政府のOISプログラム、国民健康、オーストラリアのプログラムやプロジェクトの助成金の医学研究評議会（JPFチン-塵）と大学院の奨学金（Dミッシェル）によって部分的にサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Carl Zeiss, Inc. | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu Corp. | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS - 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM - 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT - F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
References
- Lopez, A. D., Mathers, C. D., Ezzati, M., Jamison, D. T., Murray, C. J. Global and regional burden of disease and risk factors. Lancet. 367, 1747-1757 (2001).
- Szczech, L. A. Acute kidney injury and cardiovascular outcomes in acute severe hypertension. Circulation. 121, 2183-2191 Forthcoming.
- Rodriguez-Garcia, J. L., Botia, E., de La Sierra, A., Villanueva, M. A., Gonzalez-Spinola, J. Significance of elevated blood pressure and its management on the short-term outcome of patients with acute ischemic stroke. Am J Hypertens. 18, 379-384 (2005).
- Levy, D., Larson, M. G., Vasan, R. S., Kannel, W. B., Ho, K. K. The progression from hypertension to congestive heart failure. JAMA. 275, 1557-1562 (1996).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).
- Riou, S. High pressure promotes monocyte adhesion to the vascular wall. Circ Res. 100, 1226-1233 (2007).
- Ley, K., Gaehtgens, P. Endothelial, not hemodynamic, differences are responsible for preferential leukocyte rolling in rat mesenteric venules. Circ Res. 69, 1034-1041 (1991).
- Bernhagen, J. MIF is a noncognate ligand of CXC chemokine receptors in inflammatory and atherogenic cell recruitment. Nat Med. 13, 587-596 (2007).
- Woollard, K. J. Pathophysiological levels of soluble P-selectin mediate adhesion of leukocytes to the endothelium through Mac-1 activation. Circ Res. 103, 1128-1138 (2008).
- Eberth, J. F. Importance of pulsatility in hypertensive carotid artery growth and remodeling. J Hypertens. 27, 2010-2021 (2009).
- Cooke, J. P., Rossitch, E., Andon, N. A., Loscalzo, J., Dzau, V. J. Flow activates an endothelial potassium channel to release an endogenous nitrovasodilator. J Clin Invest. 88, 1663-1671 (1991).
