Summary
Pendant le processus d'infection, une étape clé est l'adhésion des agents pathogènes avec les cellules hôtes. Dans la plupart des cas, cette étape d'adhésion a lieu en présence de contraintes mécaniques générées par l'écoulement liquide. Nous décrivons une technique qui introduit la contrainte de cisaillement comme un paramètre important dans l'étude de l'adhésion bactérienne.
Abstract
Lors des infections bactériennes d'une séquence d'interactions se produisent entre le pathogène et son hôte. L'adhérence des bactéries à la surface de la cellule hôte est souvent l'étape initiale et la détermination de la pathogenèse. Bien que l'adhérence est expérimentalement étudiée principalement dans des conditions statiques d'adhérence a effectivement lieu, en présence de l'écoulement liquide. Les premières rencontres entre les bactéries et leur hôte se produisent souvent au niveau des muqueuses, bouche, poumon, intestin, yeux, etc, où le mucus s'écoule le long de la surface des cellules épithéliales. Plus tard dans l'infection, les pathogènes occasionnellement accès à la circulation sanguine provoquant des maladies mortelles telles que la septicémie, la septicémie et la méningite. Un trait caractéristique de ces infections est la capacité de ces agents pathogènes d'interagir avec les cellules endothéliales en présence de sang circulant. La présence de liquide s'écoulant, de mucus ou de sang par exemple, détermine l'adhésion, car elle génère une force mécanique sur le pathogène. Pour caractériser l'effet de l'écoulement d'un liquide se réfère généralement à la notion de contrainte de cisaillement, ce qui est la force tangentielle exercée par unité de surface par un fluide en mouvement près d'une paroi fixe, exprimée en dynes / cm 2. Intensités de contrainte de cisaillement varient largement selon les différents types des navires, la taille, l'orgue, emplacement, etc (0-100 dynes / cm 2). Circulation dans les capillaires peut atteindre des valeurs très faibles contraintes de cisaillement et même arrêter temporairement durant les périodes allant de quelques secondes à plusieurs minutes 1. À l'autre extrémité du spectre de la contrainte de cisaillement dans les artérioles peuvent atteindre 100 dynes / cm 2 2. L'impact de la contrainte de cisaillement sur différents processus biologiques a été clairement démontré que, par exemple lors de l'interaction des leucocytes avec les 3 endothélium. Pour prendre en compte ce paramètre mécanique dans le processus d'adhésion bactérienne, nous avons profité d'une procédure expérimentale basée sur l'utilisation d'un flux jetables chambre 4. Les cellules hôtes sont cultivées dans la chambre de circulation et de bactéries fluorescentes sont introduits dans le flux contrôlé par une pompe seringue. Nous avons d'abord concentré nos recherches sur le bactériennes pathogènes de Neisseria meningitidis, une bactérie Gram-négatif responsable de la septicémie et la méningite. La procédure décrite ici nous a permis d'étudier l'impact de la contrainte de cisaillement sur la capacité des bactéries à: adhérer aux cellules 1, à proliférer à la surface cellulaire et 5 pour détacher à coloniser de nouveaux sites 6 (figure 1). Des informations techniques complémentaires peuvent être trouvés dans la référence 7. Les valeurs des contraintes de cisaillement présentées ici ont été choisis en fonction de notre expérience précédente 1 et pour représenter les valeurs trouvées dans la littérature. Le protocole devrait être applicable à une large gamme de pathogènes avec des ajustements spécifiques en fonction des objectifs de l'étude.
Protocol
1. Cellule hôte de l'homme et de la culture bactérienne
- HUVEC culture entre le passage 1 et 9 à 37 ° dans un incubateur humidifié avec 5% (v / v) de CO 2. Passage des cellules quand ils s'approcheront 80% de confluence avec la trypsine / EDTA à fournir des cultures de maintenance sur 75 flacons cm 2 de culture et de cultures expérimentales en chambres d'écoulement jetables (μ-Slides VI).
- Retirer moyenne des flacons pour être repiquées, laver les cellules avec 10 ml de PBS, de retirer et le remplacer par 1,5 ml de trypsine / EDTA. Permettre aux cellules de se détacher dans un incubateur de culture cellulaire pendant 5 minutes à 37 ° C.
- Recueillir les cellules avec 10 ml de milieu de culture cellulaire dans un tube de 15 ml de collecte. Pellet les cellules avec une centrifugation de 5 minutes (à 200 g), à température ambiante. Suspendre les cellules dans 4 ml d'Endo-GDF complété avec 10% (v / v) de FBS et les compter sur une chambre de Malassez, conformément aux instructions du fabricant.
- Présentez-30 ul d'un 1x10 6 cellules HUVEC par ml de suspension dans le canal (3x10 4 au total) et permettent aux cellules d'adhérer pendant 3 heures à 37 ° dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% (v / v) de CO 2. Ajouter un volume supplémentaire de 120 pl d'Endo-GDF pour remplir les puits. Les cellules doivent former une monocouche subconfluentes (figure 2).
- Cultivez N. meningitidis exprimant la GFP (dans ce cas souche 8013 GFP exprimé sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG), sur gélose GCB contenant des suppléments de Kellogg et 5 ug / ml de chloramphénicol à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% (v / v) de CO 2 pendant 16 heures.
2. Adhérence initiale de bactéries individuelles à des cellules hôtes
- Ajuster la concentration de bactéries cultivées sur gélose GCB à une DO600 de 0,05 avec préchauffé Endo-GDF, contenant 10% (v / v) de FBS et incuber pendant 120 minutes à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% (v / v) de CO 2, sous agitation douce (130 rpm). Induire l'expression de la GFP en ajoutant 1 mM d'IPTG dans le milieu de culture pour la période d'incubation.
- Placez le jetables μ-Slide sur la scène d'un microscope inversé équipé d'une plateforme chauffé pour maintenir la température de l'échantillon à 37 ° C.
- Verser préchauffé Endo-GDF supplémenté avec 2% (v / v) de FBS dans un bécher de verre stérile et de remplir une seringue stérile de 50 ml avec ce médium. Fixez le "entrée" tube à la seringue et remplir par l'introduction à moyen terme.
- Connectez le "entrée" tuyau à la μ-Slide, avec soin, afin d'éviter l'introduction d'air dans la chambre. Puis, apposer la «sortie» du tube à l'autre extrémité et remplissez soigneusement le canal de moyenne à environ 1 cm de distance de la chambre de «sortie».
- Mesurer la DO600 bactérienne et d'ajuster à 0,15 en Endo-GDF contenant 2% (v / v) de FBS. Afin de regarder les bactéries individuelles, les agrégats doivent être perturbée par des vortex vigoureux de l'échantillon bactérien.
- Placer 100 pi d'Endo-GDF supplémenté avec 2% (v / v) de FBS milieu dans le réservoir et ajouter 100 ml de la solution bactérienne prises depuis le sommet de la solution de vortex d'éviter de prélever des autres agrégats bactériens.
- Soigneusement introduire le volume de 200 ul dans le μ-Slide en tournant le robinet d'injecter des bactéries dans la chambre.
- Présentez-Endo-GDF contenant 2% (v / v) de FBS, maintenue à 37 ° C avec la plate-forme chauffée, dans la chambre à l'aide d'une seringue avec une contrainte de cisaillement compatible avec l'adhésion de 0,044 dynes / cm 2 pendant 15 minutes.
Voir par exemple la vidéo 1 ou la figure 3. Après cette étape, soit de déplacer des articles 3, 4 ou 6.
3. Quantification de l'adhésion initiale des bactéries aux cellules hôtes individuels
- Après l'adhésion initiale pendant 15 minutes, d'acquérir des images de dix champs au hasard tandis que le liquide est toujours en circulation.
- Analyser les images acquises en utilisant le logiciel ImageJ 8, afin d'accéder au nombre moyen de bactéries adherant par champ. Cela se fait comme suit: tout d'abord, chaque image est seuillée en utilisant le «seuil» dans la fenêtre de trouver menu "Image" pour mettre en évidence individuels adhérant bactéries fluorescentes, tout en minimisant le fond des cellules. Ensuite, chaque bactérie unique est compté, en utilisant le Plug-In "Contre Cell" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Les données pour chaque image sont rapportés dans un tableur Excel et sont en moyenne de quantifier le nombre moyen de bactéries adhérentes par champ.
4. Mesure de la résistance à l'écoulement des bactéries individuelles adhérentes à cellules de l'hôte
- Programme de la pompe seringue mise en place pour générer des contraintes de cisaillement variant de 3 à 100 dynes / cm 2 pendant 5 minutes.
- A la fin des 5 minutes, l'acquisition de dix champs choisis au hasard, comme décrit dans l'étape 3.1, mais avec l'écoulement arrêté prIOR à l'acquisition.
- Analyser les images acquises comme décrit dans l'étape 3.2 et de quantifier le nombre moyen de bactéries restantes par champ.
5. Mesurer la croissance d'une bactérie isolée adhérente à une micro-
- Présentez-Endo-GDF, contenant 10% (v / v) de FBS, maintenue à 37 ° C avec la plate-forme chauffée, dans la chambre à l'aide d'une seringue avec le stress de cisaillement choisie pour plusieurs heures. Enregistrement des images pour la microscopie vidéo en temps réel à une image toutes les 5 minutes.
- Suite à la microscopie vidéo, arrêtez la contrainte de cisaillement en désactivant la pompe seringue, d'acquérir des images supplémentaires 2-3 puis arrêter la séquence d'acquisition d'image sur le logiciel. Un exemple de la prolifération bactérienne peut être vu sur la vidéo 2.
6. Mesure de la résistance à l'écoulement des microcolonies bactériennes adhérente
- Après la formation de microcolonies grande à la surface cellulaire (step5.2) acquérir 2-3 images des deux cellules (par contraste de phase) et des bactéries (par la GFP-fluorescence) avant l'application de flux. Pour le reste de l'expérience, le protocole d'acquisition sera de surveiller que la fluorescence.
- Application des contraintes de cisaillement élevées pendant 5 minutes (300-100 dynes / cm 2) et d'enregistrer des images à une image toutes les 5 secondes.
- Arrêtez la contrainte de cisaillement en désactivant la pompe seringue, d'acquérir des images supplémentaires 2-3 puis arrêter la séquence d'acquisition d'image sur le logiciel.
- Ensuite, retirez la "sortie" première tubulure et soigneusement, pour éviter de vider le canal, puis ajoutez préchauffé milieu frais pour remplir les puits avant d'enlever le "entrée" tubes.
- Pour déterminer quantitativement l'effet de la contrainte de cisaillement sur la résistance bactérienne, un dosage de plaquage peut être effectuée comme suit: recueillir le milieu restant et laver les μ-Slide deux fois avec 120 pl de PBS, qui enlève le milieu restant du canal (deux lavages sont ) a également recueilli.
- Détacher les cellules infectées par l'ajout de 50 pi de trypsine / EDTA pendant 5 minutes à 37 ° et mélanger cet échantillon indépendante avec la suspension recueillis à l'étape précédente.
- Effectuer des dilutions en série dans du PBS et la plaque une fraction de 10 ul sur des plaques de gélose GCB, en trois exemplaires, afin de déterminer le nombre d'unités formant colonies (UFC), le jour suivant, après l'incubation des plaques à 37 ° C dans un incubateur à 5% (v / v) de CO 2.
Vidéos 3 et 4 comparer la souche de type sauvage avec le mutant pilV.
7. Décollement de microcolonies bactériennes
- Infecter les cellules dans la chambre d'écoulement en répétant les étapes 2.1 à 2.8 et permettent l'infection se poursuivre pendant 30 minutes.
- Retirer bactéries non en augmentant le flux à 10 dynes / cm 2 pour une période de 2 minutes et laisser l'infection se poursuivre pendant 2h.
- Réduire le débit à 0,15 dynes / cm 2.
- Chaque heure, de recueillir une goutte de milieu sortant de la chambre d'écoulement.
- Effectuer des dilutions en série des échantillons et leur plaque sur gélose GCB.
- Déterminer le nombre d'unités formant colonies (UFC), le jour suivant, après l'incubation des plaques à 37 ° C dans un incubateur à 5% (v / v) de CO 2.
8. Les résultats représentatifs
Figure 1: Différentes étapes d'une monocouche cellulaire qui peuvent être observés et mesurés en présence de l'écoulement dans la procédure.
Figure 2: monocouche de cellules endothéliales dans la chambre de circulation au début d'une expérience (absence de cisaillement). Environ 50 cellules endothéliales sont organisés en une monocouche sous-confluente.
Figure 3: représentation graphique de l'adhésion initiale des bactéries à la surface cellulaire. Les valeurs des trois champs sont indiqués pour donner une idée de la variation de champ à champ qui est prévu (0044 dynes / cm 2).
Vidéo 1. Visualisation de l'adhésion initiale des bactéries sur la monocouche cellulaire en fonction du temps (0044 dynes / cm 2). Exprimant la GFP bactéries sont en suivant la direction du milieu coule. Le film est accéléré de 60 fois, la durée réelle de la vidéo est de 10 minutes.
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Vidéo 2. Après l'adhésion initiale des bactéries ont été autorisés à proliférer à la surface cellulaire pour une période de 7 heures (accélérée 1000 fois).
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Vidéo 3. Après la prolifération à la surface cellulaire le mécanicienRésistance al de microcolonies a été testé en augmentant le niveau de stress de cisaillement à 10 dynes / cm 2 pendant 5 minutes, mais microcolonies de type sauvage sont résistants accélération de 60 fois.
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Microcolonies vidéo 4. Formé par le mutant pilV sont perturbés par augmenter le flux (10 dynes / cm 2). Ce mutant ne parvient pas à induire le remodelage de la membrane plasmique en microcolonies et est donc plus très sensibles à la contrainte de cisaillement augmente (la vidéo est accélérée 60 fois) 5.
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Discussion
L'importance de la contrainte de cisaillement et généralement des aspects mécaniques de la biologie est de plus en plus reconnu. Par exemple, les propriétés hautement adaptées adhésif de la famille des sélectines de protéines dans le processus d'adhésion des lymphocytes et roulant sur la paroi vasculaire a été reconnu par l'introduction de la contrainte de cisaillement dans le processus. La procédure décrite ci-dessus a été appliquée à l'meningitidis bactéries à Gram négatif Neisseria mais devrait être applicable à un large éventail d'agents pathogènes. L'importance de la contrainte de cisaillement a été montré aussi pour d'autres pathogènes et les sites d'autres infections. Adhésion bactérienne conditionnée par la contrainte de cisaillement a été décrit par l'étude de l'adhésine FimH trouvé sur Escherichia coli uropathogènes (UPEC) 9. Similaire à sélectines, l'interaction entre FimH et son récepteur de la cellule hôte a été montré pour être renforcée par cisaillement induite par des forces mécaniques 9 et l'adhésine CFAE des E.coli entérotoxinogène a été rapporté également de servir de médiateur d'adhérence aux cellules épithéliales via un cisaillement-dépendant mécanisme 10. Nous avons signalé, en utilisant le protocole flux laminaire chambre de dosage décrite dans ce chapitre que Streptococcus agalactiae pili étaient essentiels pour l'adhésion de cet agent pathogène aux cellules épithéliales dans des conditions d'écoulement 11. De telles études confirment que notre test de la chambre de flux est un outil utile pour enquêter sur des cellules hôtes-pathogènes dans des conditions de contrainte de cisaillement.
Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier Emilie Mairey et Emmanuel Donnadieu pour le réglage initial de la procédure.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 | |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | BD Biosciences | 300865 | |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher Scientific | R3603 | |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 | |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon Instruments | Eclipse Ti | |
| CCD camera | Hamamatsu Corp. | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD | |
| ImageJ software | National Institutes of Health | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
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