In vivo Dual Substrat Bioluminescent Imaging

Summary

Häri beskriver vi de metoder för att konstruera, visualisera och kvantifiera de självlysande reaktioner både Firefly och Renilla-luciferas enzymer uttrycks i metastatiska bröstcancerceller under sin tillväxt och metastasering

Abstract

Vår förståelse av hur och när bröstcancer celler transit från etablerade primära tumörer på metastaser har ökat i en exceptionell hastighet sedan tillkomsten av in vivo bioluminescent imaging-teknik ^1-3. Faktum möjligheten att lokalisera och kvantifiera tumörtillväxt longitudinellt i en enda kohort av djur till slutförandet av studien i motsats till att offra enskilda grupper av djur vid analysinstruktioner tider har revolutionerat hur forskare undersöker metastaser bröstcancer. Tyvärr, nuvarande metoder utesluter realtid bedömning av kritiska förändringar som genomsyra i cellsignalering system som bröstcancerceller (i) utvecklas inom primära tumörer, (ii) sprida i hela kroppen, och (iii) återinitiera proliferativa program på platser för en metastatisk lesion. Den senaste tidens framsteg inom självlysande bildbehandling gör det nu möjligt att samtidigt kvantifiera specifika spatiotemporal förändringar i genuttryck som en funktion av tumörutveckling och metastatisk progression via användning av dubbla reaktioner substrat luminiscens. För att göra detta, forskarna utnyttja för två ljus-producerande luciferas enzymer isolerade från eldfluga (Photinus pyralis) och havet pensé (Renilla reniformis), vilka båda reagerar på ömsesidigt uteslutande substrat som tidigare underlättat deras utbredda användning i in vitro-cell -baserade rapportgenprodukter analyser ^4. Här visar vi in vivo användbarheten av dessa två enzymer så att en luminiscensreaktion specifikt markerar storleken och placeringen av en utvecklande tumör, medan den andra luminescerande reaktionen fungerar som ett medel för att visualisera aktiveringsstatus av specifika signalsystem under distinkta stadier av tumör och metastas utveckling. Således är syftet med denna studie är två gånger. Först kommer vi att beskriva de åtgärder som är nödvändiga för att bygga dubbla självlysande linje reporter cells, liksom de som behövs för att underlätta deras användning vid visualisera spatiotemporal reglering av genexpression under vissa steg av metastatiska kaskaden. Använda 4T1 modellen av bröstcancer metastaser, visar vi att in vivo aktiviteten av en syntetisk Smad bindningselement (SBE) promotorn minskade dramatiskt i pulmonell metastas jämfört med den som uppmätts i den primära tumören ^4-6. Nyligen, har bröstcancer metastas visat att regleras av förändringar i den primära tumören mikromiljön och reaktiv stroma, inklusive de som förekommer i fibroblaster och infiltrerande immunceller ^7-9. Således kommer vår andra mål vara att påvisa nyttan av dubbla självlysande tekniker i övervakningen av tillväxt och lokalisering av två unika cellpopulationer hyste i ett enda djur under bröstcancer tillväxt och metastasering.

Protocol

1. Stabilt uttryck av CMV-Driven Renilla luciferas

1. Transfektion och selektion av en stabilt klonal population är den föredragna metoden för expression av detta Renilla luciferas reporter. Detta tillvägagångssätt ger en mer konsekvent och likformig Renilla luciferasexpressionsnivån efter den efterföljande införandet av ytterligare sekundära reporterkonstruktioner (t.ex. eldflugeluciferas eller fluorescerande proteiner).
2. Transfektera maligna celler av intresse med expressionsvektorn som kodar Renilla luciferas, såsom pcDNA3.1-Hygro eller annan plasmid som härbärgerar en selekterbar markör.
3. Efter transfektion, placera transfektanter under en optimerad koncentration antibiotikum i flera dagar-till-veckor för att underlätta isolering av enskilda kolonier, vilka därefter isoleras individuellt och subodlades.
4. Välj ≥ 10 individuella Renilla luciferas-uttryckande kolonier för att övervaka omfattningen av Renilla uttryck.
(i) patofysiologiska egenskaperna hos sina föräldrar motsvarigheter behålls, och (ii) Renilla uttryck värden inte avviker eller förändras över tiden. Dessa steg är absolut nödvändigt för att undvika isolering och studera klonala varianter / avvikare och att validera korrekt integrering av Renilla konstruktionen i genomet.
5. När en stabil transfektant isoleras och verifieras, kan man avlägsna den selektiva trycket och vara säker på att uttrycket av Renilla-luciferas kommer att förbli konstant över långa tidsperioder både in vitro och in vivo.

2. Uttryck, urval och funktionell verifiering av promotor-Driven eldflugeluciferas

1. Subklona promotorn av intresse in i en pGL4-luciferas reporterplasmid härbärgerar en selekterbar markör (t.ex. puromycin) som är skild från den som används för att selektera för stabil uttryckning Renilla (t.ex., hygromycin).
2. Transfektera maligna celler som i steg I, och därefter selektera för en stabil polyklonal population av eldflugeluciferas-uttryckande celler. Eftersom platsen där en rapport gen integreras i genomet kan framkalla felaktiga effekter på dess uttryck och reglering, rekommenderas det starkt att välja för polyklonala populationer av eldflugeluciferas-uttryckande celler i motsats till klonala populationer för att säkerställa att (i) uttryck reportergen bättre speglar den hos den endogena genen i moderceller, och (ii) integration effekter på genuttryck medelvärdesbildas och minskar över heterogena cellpopulationen.
3. Maligna celler manipulerade att stabilt uttrycka både Renilla och Firefly luciferaser kollektivt kallas dubbla självlysande reporter celler eller DBR celler.
4. Med traditionella <em> in vitro cellbaserade luciferasanalyser reportergen, kontrollera att DBR cellerna reglerar eldflugeluciferas uttryck, antingen positivt eller negativt, på ett sätt som samstämmig med vad som observerats i moderceller transient transfekterade med dessa vektorer. Likaså kontrollera att CMV-driven uttryck Renilla inte regleras av olika cell stimuli eller villkor behandling.
5. För att göra detta, kultur DBR och moderceller i 24-brunnar, och därefter transient sam-transfektera parentala celler med den ursprungliga CMV-Renilla och promotor-firefly konstruktioner används för att generera DBR celler.
6. Efteråt behandla DBR och transfekterade parentala celler med faktorer eller läkemedel som man vet att reglera främjare av intresse och därefter kvantifiera firefly och Renilla luminiscens med Promega Dual Luciferase Assay Kit.

3. Etablera 4T1 Primära brösttumörer

1. Metastatiska 4T1 bröstcancer celler som vire sakna adventitiala gnagare patogener var konstruerad för att stabilt uttrycka en CMV-driven Renilla luciferas (pcDNA3.1-CMV-Renilla luciferas-hygro) och en SBE driven eldflugeluciferas (pGL4.2-SBE-eldflugeluciferas-puro) som beskrivits ovan. Ortotop inympning av dessa bröstcancerceller resulterar i bildning av spontana metastaser huvudsakligen i lungorna.
2. 4T1 celler bör inte tillåtas att nå sammanflödet under förökning i traditionella 2-dimensionella vävnadsodlingssystem, och de bör passera dagen före deras in vivo ympning.
3. 4T1 celler bör vara dissocieras genom trypsinisering, tvättades grundligt i odlingsmedium, och späddes i PBS till en koncentration av 2x10 ⁵ celler / ml och lagrades omedelbart på is.
4. Balb / C-möss (4-6 veckor gamla) bör vara bedövas med en induktion dos av 3% isofluran och hölls under anestesi vid en dos av 1% isofluran. Förbered injektionsstället genom badda med70% isopropylalkohol. Med hjälp av en pincett försiktigt tag och lyft den 4: e inguinal bröst pad. Försiktigt, placera en 27,5 gauge sida nål avfasning uppåt och injicera i juverfett pad direkt under bröstvårtan, med särskild försiktighet inte trycker in nålen i bukhålan. Släpp körteln och långsamt injicera 50 | il av cellsuspensionen (1x10 ⁴ celler) in juverfett dynan.

4. Initial Dual Luminescent Imaging

1. Omedelbart efter engrafting 4T1 celler på juverfett dynan och medan mössen fortfarande bedövades, injicera 100 pl RediJect Coelenterazine i den laterala svansvenen. Detta är den optimala substratkoncentrationen rekommenderas av säljaren och bäst tolererade av djuret.
2. Omedelbart placera musen i den isofluran noskonen inom IVIS-200 bildsystem och skaffa en 0,5-1 minuter självlysande bild. Effektivitet mellan injektion och bildinsamling är mycket viktig, eftersom signalenför Renilla-luciferas sjunker brant ~ 30 sekunder efter injektion. Placera musen tillbaka till sin bur och låt den återhämta ≥ 1 timme, vilket säkerställer att alla kvarvarande Renilla luciferas signalen har försvunnit och att musen har återhämtat sig helt från anestesi.
3. Administrera 150 mg / kg D-luciferin kaliumsalt via IP injektion och vänta i 5 minuter. Detta är den optimala koncentrationen av D-luciferin, vilket ger en stabil luminiscent signal i 5-15 minuter efter dess injektion i försöksdjur. Söva musen med hjälp isoflourane och ersätta i IVIS-200, var noga med att placera djuret på ett mycket liknande position i förhållande till den ursprungliga Renilla förvärvet. Den totala intensiteten av denna eldfluga signal beror på aktiviteten av promotorn av intresse, och som sådan, visualisera eldflugeluciferas aktivitet kan kräva utökade Hämtningstider.
4. Använda IVIS programmet Living Image inställd på "fotoner"-läge, etablera värdefullaes för både Renilla och Firefly förvärv som ett sätt att fastställa nominella relativa luminiscens nyckeltal (RLR).

5. Längsgående Luminescent Imaging

1. 4T1-celler är mycket aggressiva, leder så att ympning av 1x10 ⁴ celler typiskt palperbar tumörbildning inom 1 vecka, och till dödligheten hos djuret inom 4-5 veckor. 4T1 tumörer har en inneboende benägenhet sår i vecka 4. Tillväxt och underhåll av såriga tumörer kan kräva separata IACUC godkännande. De 4T1 tumör studier visat häri har godkänts av IACUC vid Case Western Reserve University.
2. Såsom beskrivits ovan, bör möss injiceras varje vecka med RediJect Coelenterazine att övervaka allmän tumörtillväxt och metastas, samt med D-luciferin att övervaka väg-specifik signalering under olika stadier av tumörutveckling. Ta hand varje gång för att säkerställa att Renilla luciferas signalen helt har försvunnit före förvärvav eldflugeluciferas signalen.
3. Som 4T1 tumörer utvecklas och framsteg bör Renilla-luciferas förvärv normaliseras till de ursprungliga Renilla uppmätta vid tumörcellen ympning som ett sätt att normalisera och spåra primär tumörtillväxt. Ännu viktigare, kommer beräkningen RLR värden över tiden skapa den tidsmässiga regleringen av enskilda signalsystem relativt tumörtillväxt och progression.
4. Öppen pulmonell metastaser visar sig inom 3-4 veckor efter 4T1 cell engraftment på juverfett pad. Jämföra pulmonell RLR värden jämfört med dem som beräknats för den primära tumören etablerar den rumsliga regleringen av enskilda signalsystem relativt tumörtillväxt och metastasering.

6. Dubbel Bioluminescent avbildning av två unika celltyper i ett enda djur

1. Ingenjör en bröstcancer cellinje till stabilt uttryck CMV-driven Renilla-luciferas som beskrivet ovan. Upprepa dettakonstruktionsprocessen med CMV-driven eldflugeluciferas på en andra distinkt bröstcancer cellinje.
2. Häri vi blandade Renilla-luciferas-uttryckande 4T1-celler med deras icke-metastaserad och isogena eldflugeluciferas-uttryckande motsvarigheter 4T07 ^{10, 11.} Varierande förhållanden mellan dessa blandade bröstcancercellinjer populationer därefter injiceras i bröstkörteln fettkudden såsom beskrivits ovan.
3. Omedelbart få både Firefly och Renilla-luciferas bilder att upprätta inledande RLRs representerar en inokulerade given cell blandning.
4. Längsgående dubbla bioluminescent imaging kommer visualisera och spåra förändringar i den cellulära sammansättningen i den primära tumören, liksom Spatiotemporal metastasering av varje bröstcancer derivat i förhållande till tumörtillväxt och progression.
5. Alternativt kan enskilda bröstcancer cellpopulationer ympas in i olika lägen i musen (dvs. höger och vänster buken juverfett kuddar)att bedöma de systemiska influenser dessa två populationer uppvisar över varandra under olika stadier av tumörtillväxt och metastasering.

7. Representativa resultat:

En stor styrka dubbla självlysande avbildning ligger i det faktum att varje bild är internt konsekvent och kontrollerad, så att de fortsatta signaler som härrör från den primära tumören fungera som en viktig statistik att mäta den totala framgång eller misslyckande för varje Renilla och eldfluga förvärvet. Denna aspekt av avbildning förfarande är särskilt viktigt under förvärv av verksamhet Renilla luciferas, vars Coelenterazine substrat är mycket känslig för oxidation som resulterar i dess förmåga att automatiskt luminiscens. Figur 1A visar ett exempel på denna biverkan, som omedelbart manifesteras som ospecifika luminiscerande signaler härledda från tarmkanalen, inte etablerade primärtumören. Typiskt, signalerar dessa ospecifik Coelenterazine transpire efter misslyckad intravenösa injektioner av denna Renilla luciferas substrat. Men när robusta primära tumörhärledda Renilla signaler har erhållits (Figur 1B, vänster bild), är det säkert att fortsätta fånga väg-specifika signalering mätningar som härrör från avbildning eldflugeluciferas (Figur 1B, högra panelen), vars D-luciferin substrat är mycket stabil vid IP-injektion och producerar försumbara nivåer av bakgrundssignal automatisk luminiscens.

Figur 1. Förvärva Renilla och eldfluga-härledda bioluminescenta bilder för att beräkna in vivo RLRs. (A) Ett exempel på en misslyckad IV-injektion av Coelenterazine resulterar i ospecifik signal från tarmkanalen. Cirkel och PT visar den ungefärliga platsen för den primära tumören. (B) En lyckad Renilla förvärv av en mus som bär en 4T1 primär tumör och pulmonary metastaser (vänstra panelen, 4wk efter fett pad engraftment). Motsvarande eldfluga Förvärvet möjliggör för beräkning av RLRs från både den primära tumören och dess pulmonell metastaser. (C) Grafisk representation av den primära tumören och pulmonell RLRs metastaser räknat från möss som visas i panel B (n = 4).

Discussion

Den absoluta makt självlysande avbildningstekniker ligger i deras förmåga att kvantifiera tumörtillväxt och metastasering i komplexa longitudinella studier, som här är involverade användningen av aggressiva 4T1 bröstcancerceller. Eftersom dessa förfaranden förlitar sig på den stabila integrationen av både luciferas reporterkonstruktioner, kan dessa tekniker kan lätt anpassas och översättas till andra cancercellinjer av varierande tumör latenser och metastatiska kapacitet. I likhet med de resultat som visas här, beräkna specifika RLRs inom långsamt utveckla primära tumörer och deras eventuella metastaser möjliggör realtid Spatiotemporal identifiering av specifika signalering händelser som genomsyra under metastaserande progression av tumörer oavsett längd latens. Vid identifiering av specifika promotor regulatoriska händelser är det viktigt att skära både den primära tumören och dess metastaser för utförandet av standard immunhistokemiska och differentieringl genuttryck analyser för att verifiera liknande reglering av den endogena genen och / eller protein.

Tekniskt sett den primära utmaningen dubbla självlysande analyser ligger på relativt kort varaktighet Renilla-luciferas signalerna. Som sådan kräver denna avbildningsteknik signifikant optimering av svansveninjektion förfarande, liksom omedelbar avbildning av individuellt injicerade djur, en process som är tidsödande och något ineffektivt i förhållande till avbildning eldflugeluciferas. Nyligen introducerade Promega "Viviren," som representerar ett andra substrat generationens luciferas vars ställen för oxidation blockeras genom förestring tills denna molekyl vinster inträde i celler, vid vilken punkt molekylen är snabbt avestrad. Sammantaget sänker denna roman substrat effektivt automatisk luminiscens och ospecifik modifiering och / eller nedbrytning kopplat till Renilla-inducerad auto-luminiscens ^12. Härvid denna nya renillen luciferassubstrat ger klarare självlysande signaler, men har de höga kostnader i samband med förvärvet och användningen av "Viviren" som relativt få studier som krävs för att utvärdera den samlade nyttan av detta substrat i dubbla självlysande analyser. Slutligen, är känsligheten av varje bioluminescensanalys kritiskt beroende på CCD-kameran operanta förvärva enskilda ljusenheter. Verkligen, som denna teknik förbättras ser vi en punkt i framtiden där vår förmåga att visualisera komplexa ljus-medierade självlysande reaktioner kan genomsyra effektivt i fria rörliga djur ^13.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
pGL4.2-Puro [luc2/Puro] Vector	Promega Corp.	E6751
Glomax Mult-idection system	Promega Corp.
IVIS 200 series	Caliper Life Sciences
Dual luciferase reporter Assay system	Promega Corp.	E1960
Rediject c–lenterazine-h	Caliper Life Sciences	760506
D-Luciferin K-Salt	Caliper Life Sciences	122796