אקוטי וכרוני בדיקה חושי טקטילי לאחר פגיעה בחוט השדרה של חולדות

Summary

נתאר שתי שיטות בדיקה מישוש חושיות לתקופות חריפה או כרונית של פגיעה בחוט השדרה של חולדות. נהלים אלה תוקף יכול לזהות פיתוח ותחזוקה של allodynia כמו תחושות.

Abstract

פגיעה בחוט השדרה (SCI) פוגעת במערכות חושיות הגורמות allodynia ^1-8. כדי לזהות גורמים תאית ומולקולרית של allodynia, רגישה בדיקה חושית תקף מודלים חולדה מדע צורך. עם זאת, עד לאחרונה, הגישה לא בדיקה אחת לא אומתו על SCI כך שיטות סטנדרטיים לא יושמו על מעבדות. בנוסף, שיטות בדיקה הזמינים לא יכול להיות מיושם בצורה אקוטית חמורה או כאשר המנוע ליקויי קיימים, מניעת מחקרים על התפתחות של SCI-Induced allodynia ^3. כאן אנו מציגים שתי שיטות תוקף בדיקה חושית באמצעות פון פריי שיער (VFH) monofilaments אשר לכמת שינויים ספי החישה מישוש לאחר SCI ^4-5. בדיקה אחת היא מבוססת היטב עד למטה הבדיקה אשר מדגימה רגישות וספציפיות גבוהה ברחבי שונים severities מדע כאשר נבדק באופן כרוני ^5. המבחן השני הוא מבחן החדש שפותח VFH הגב שניתן להחיל בחריפות לאחר SCI כאשרllodynia מפתחת, לפני המנוע התאוששות ^4-5. כל monofilament VFH מפעיל כוח מכויל כאשר נגע על העור של כף רגל אחורית עד שהוא מתכופף. בשיטה למעלה למטה, VFHs מתחלפים של כוחות גבוהות או נמוכות יותר משמשים על dermatome L5 plantar להתוות ספי מכופף גמילה. כוחות ברציפות יותר מיושמים עד הנסיגה מתרחשת אז VFHs כוח נמוכים משמשים עד הנסיגה מפסיקה. סף מישוש משקף את הכוח הדרוש כדי לעורר משיכה 50% הגירוי. המבחן החדש, VFH כל מוחל על dermatome L5 הגבי של כף רגל תוך עכברוש נתמך על ידי הבוחן. גירוי VFH מתרחשת בסדר עולה בכוח עד לפחות 2 מתוך 3 בקשות לעבר כוח מסוים מייצר הנסיגה כפה. סף חושי המישוש הוא הכוח הנמוך ביותר כדי לעורר משיכה 66% מהזמן. נהלים, הסתגלות בדיקה הניקוד מתוארים. ניסויים חריגים שדורשים כמה ניסויים לבדוק שוב טיפוסית מוגדרים. השימוש בבעלי חיים Wכפי שאושר על ידי אוניברסיטת אוהיו בעלי חיים טיפול המדינה ועדת שימוש.

Protocol

1. מעלה / מטה Plantar פון פריי בדיקה

מטרת הבדיקה היא לקבוע רגישות מישוש על ידי מדידת כמה כוח רב נדרש כדי לעורר משיכה כפה מגירוי. זמינים מסחרית מכויל פון monofilaments פריי שיער בין הטווחים של 4.56 ו 6.10 משמשים כדי לעורר את הכף. קלט חושי אחר כמו ויזואליזציה של גירוי או הפרופריוספציה יכול לבלבל אמצעים סף מישוש כל התגובות בהתבסס על קלט חזותי או הפרופריוצפטיבית אינם חוקיים. כדי למנוע ויזואליזציה של monofilament נוגע בעור, אנו בוחנים רק כאשר החולדה אוכלת דגני בוקר. זה לבדרן קוגניטיבית, גם מבטיח כי כל העכברושים נבדקים ברמות הבסיסיות דומים של נחמה. כדי למנוע תגובות בשל הפרופריוצפטיבית ולא טקטילי, אנחנו לא כוללים ניסויים שבהם monofilament מרים או מזיז את הכף.

א נהלי הסתגלות עבור גישה UP-DOWN

1. פירות הנוכחי cereaאני בכלוב בבית אז חולדות לזהות לחפש גמול מזון. חולדות לא צריך להיות מקופח מזון בכל נקודה בתהליך ליטפה או בדיקה.
2. חולדות מוכנים הסתגל לסביבה בדיקות ונהלים פעם הם אוכלים דגנים ופירות בכלוב הביתה. ההסתגלות מתרחשת על לפחות 4 מפגשים בני 10 דקות כל אחד, אלא יותר עשוי להיות נחוץ. עשרה מפגשים דקות משמשים כך החולדות לא להיות שבע לפני תום הפגישה.
3. מניחים את החולדה בתא בדיקה עם שלוש חתיכות של פירות לדגנים. ספק דגנים פירות נוסף 1-2 בכל פעם, כאשר הם נאכלים. על המפגש בעוד 3 חולדה אוכלת, לייצר תנועות ידיים מתחת לרצפת התיל כך עכברוש מתרגל לתנועה מתחת רגלו. על הפגישה 4, החל את monofilament 5.18 אל פני השטח הפלנטרי של כף בערך פעם בדקה עבור סכום כולל של עשרה מצגות. עכברוש נאיבי לא צריך להגיב לגירוי לסף זה משנה.
4. גבוה-y חלקי הדגנים הנצרכים, תדירות הטלת שתן והפרשת צואה, מקפיא, והתנהגויות הטיפוח. התנהגות הקפאה מתרחשת בשתי דרכים: א) חולדה הוא מתכופף לרצפה בדרך כלל ליד הקיר האחורי או עם הגב הבוחן ונשאר ללא תנועה, ב) חולדה הוא רכון באמצע הכלוב ובדרך כלל לפטפט שיניו . התנהגויות הקפאת עשויה להימשך תקופות ארוכות.
5. עכברוש הרגיע כי הוא מוכן לבדיקה יאכלו כמעט ברציפות במשך 10 דקות. זה יעבור בקלות בכלוב ולחפש דגנים פירות מהר מאוד לאחר צריכת האחרון. חשוב לציין, עכברוש לא יפסיקו לאכול או להיות מוסחת על ידי תנועות ידיים מתחת לרצפה חוט או יישום monofilament את הכף.

ב תהליכי הבדיקה עבור גישה UP-DOWN

1. חולדות לייצר vocalizations מצוקה, כי הם מעל טווח שמיעתי האנושי שלנו. חולדות הממתינים להיבדק יש לשמור בחדר נפרד, כך שהם לא יכולים לשמוע אותם VOCalizations.
2. חולדות עם פגיעה בחוט השדרה המתאימים עד למטה בדיקות שיער פריי פון חייב להוכיח נושאת משקל עם הגפיים. איברים אינם יכולים לתמוך עכברוש לא ניתן לבדוק באופן מהימן, כי היישום של monofilaments מעביר את הכף לפני עיקולים שיער.
3. מניחים חולדה בחדר בדיקה עם 2 או 3 חתיכות של פירות לדגנים. חולדות יש לאכול במהלך כל יישום VFH.
4. לגלגל קובייה כדי לקבוע אילו HL להתחיל בדיקות 1. אפילו המספרים מייצגים את כפה הימנית ומספרים מוזרים לייצג את השמאל.
5. להתחיל את הפגישה עם בדיקות monofilament 5.18. תגובות גמילה יכול להתרחש 4.56-6.10 בעכברים נורמליים SCI ו monofilament 5.18 נופל באמצע הטווח.
6. אין ליישם monofilament תוך עכבר קופא, משתופף או לא לאכול. אם הבוחן מחכה, לעתים בתנאים אלה יפתור ובדיקה יכול לחדש. אם חולדה מציג התנהגויות אלו ואת הזמן הכולל של האפליקציהaratus הוא 20 דקות, לעצור את בדיקות בדוק שוב מההתחלה למחרת. אל תסיר את החולדה בזמן שהוא מציג התנהגויות אלו שכן הדבר עלול להגביר את הופעתם. המתן עד עכברוש פורץ את הדפוסים הללו לפני הטיפול בו, כדי למנוע חיזוק התנהגויות אלו.
7. לגעת monofilament כדי dermatome plantar L5 של כף רגל אחורית בין כריות כף הרגל עד שהוא מכופף (ראה תרשים 1 א). יישום זה יציב חלק צריך לקחת על השני ואז להסיר אותו מן העור. להימנע מלגעת באף חלק של כריות כף הרגל כמו רגישות של העור הוא הרבה יותר נמוך באזורים אלה. זה קשר אחד מהווה את אחד לדין.
8. תשובה חיובית מתרחשת כאשר החולדה במהירות מרים את הכף מן monofilament. הנסיגה יש ליזום עד monofilament מוסר כדי לאשר את התגובה קשור ליישום monofilament.
9. לראות את בעלי החיים על ראיה אחרת של מודעות של מוnofilament מגע כגון ניקוד, מביט כלפי מטה, אחורה או כפה נבדק, מלקק, כפה כפה נסיגה מתמשכת או רעד האוזניים. הערה אותם על דף הנתונים. כאשר התנהגויות אלו להתרחש עם הנסיגה כפה הוא מהווה עדות לתפיסה supraspinal הגירוי.
10. אם יש תגובה חיובית, החל את monofilament הנמוך ביותר הבא. אם אין תגובה (שלילי), להעביר עד monofilament גבוהה הבא. אפשר 30 שניות בין כל יישום monofilament על קולטנים חושיים שיחזרו לירי הבסיס לפני retesting (כדי למנוע הסתגלות).
11. המשך יישום monofilaments גבוהה או נמוכה כף אחורית המבוססת על תגובות חיוביות או שליליות עד שיש לך 10 ניסויים. לאחר מכן חזרו על הכף האחורית השני. (ראה דף נתונים למשל).
12. VFH הגבוה ביותר ניתן לבדוק ללא החדרת פרופריוצפטיבי והרמת הכף הוא 6.10. 6.45VFH ויותר אין להשתמש כי כפה מרים לפני monofilament מתכופף. אם אין תגובה על 6.10 ולאחר מכן את המשפט הבא יחול 6.10 שוב.
13. התגובה צריכה להיות בטלה, והמשפט יש לבדוק מחדש אם אחד מאלה במהלך יישום גירוי או נסיגה כפה:
    1. עכברוש לא ברציפות לאכול.
    2. עכברוש מתרחק גירוי VFH לפני כיפוף של חוט, כך שלא ניתן לדעת את הכוח ליישם את זה מעורר את תגובת נסיגה.
    3. כפה יוסר על ידי VFH (לפני או אחרי VFH הוא כפוף) מתן הפרופריוצפטיבית בנוסף לגירוי חוש המישוש.
14. הפגישה בדיקות בדרך כלל ניתן להשלים בתוך פחות מ -15 דקות עבור hindlimbs הצדדים.

ג נתונים עיבוד הגישה UP-DOWN

1. ניסוי מוצלח יהיה 10 ניסויים עוקבים על כל כף רגל.
2. ערך סף מישוש הוא monofilament הנמוך ביותר המייצר הנסיגה כפה על & Gדואר: 50% מצגות 3 או יותר מצגות של monofilament לא תינתן (ראו גליון הנתונים למשל, ספי הם עיגול מסומן).
3. Monofilament עם רק 2 ניסויים בסך הכל לא נבחר הסף גם כאשר 1 הוא משפט חיובי ואחד שלילי. מצגות רבות של הגירוי הם אינדיקטורים טובים יותר של דפוס של התגובות הכוח.
4. אם אין monofilament שמייצר תגובות חיוביות על לפחות 50% מהבדיקות, עכברוש מקבל ציון של 6.45. משמעות הדבר היא כי חולדה לא לזהות monofilament לבדוק בדיקה הגבוהה ביותר של 6.10 מעבר סיכוי אקראי. הערך של 6.45 ניתנת משום שהוא מייצג את הערך הבא גבוה יותר מאשר טווח לבדוק בדיקה של monofilaments.
5. להמיר את ערך הסף את הכפות על ימין ועל שמאל לתוקף גרם. ערכי כוח גרם יסופק על ידי ספק של השערות פריי פון. . עבור נתונים פציעות הבילטראליים, גרם סף כוח לשני הכפות ניתן בממוצע יחד כדי להניבציון אחד.

2. הגב פון פריי בדיקה

מטרת הבדיקה הזו הינה לקבוע רגישות מישוש בחולדות עם שליטה מוטורית דלה כזו שלא ניתן לבדוק באמצעות שיטות אופייניות VFH plantar. זה מכמת כמה כוח מגע הוא צורך לייצר תגובה מרתיעה. כדי למנוע תגובות לגירויים פרופריוצפטיביות, אנחנו לא כוללים ניסויים שבהם כפה מועברת על ידי VFH במהלך היישום. בנוסף, אנו לא כוללים ניסויים שבהם VFH נופלת או מברישים על פני השטח הגבי של כף הרגל.

א נהלי הסתגלות ל הגבי פון פריי בדיקות

1. חולדות עדין ארבעה מפגשים בני 10 דקות כל אחד לפני המבחן המחקר ולאחר פגיעה בחוט השדרה.
2. רופף לעטוף את העכברוש במגבת קטנה כל כך את אחוריו חשופים כמוצג להלן (1B איור). מקם את עכברוש על השולחן עם רגליים אחוריות קלות נח על פני השטח. השתמש באותוצמוד אבל לא נצמד חזק לחיצה ארוכה על כל חולדה. מרענן הזרוע שלך על קצה השולחן עשוי להפחית השונות בין חולדות.
3. עכברוש הרגיע כי הוא מוכן לבדיקה לא להתנגד מוחזק במגבת במשך דקות רצופות, אולם ייתכן שיהיה צורך לעטוף מחדש את העכברוש 1 או 2 פעמים במהלך בדיקה של שתי כפותיו האחוריות.

ב נוהלי בדיקת הגבי פון פריי בדיקות

1. לגלגל קובייה כדי לקבוע איזה איבר האחוריות כדי להתחיל בדיקות 1. אפילו המספרים מייצגים את כפה הימנית ומספרים מוזרים לייצג את השמאל.
2. רופף לעטוף את העכברוש במגבת ומשאירים את החלק האחורי חשוף.
3. גירוי טקטילי מוחל רק לאחר עכברוש רגוע ושקט לפחות 10 שניות.
4. החל VFH 4.56, החל את monofilament בניצב לפני השטח הגבי של כף הרגל בין 1 ו 2 כ 1 ס"מ פרוקסימלי ל משותף (איור 1 ג). החל monofilament ב STE, חלקבאופן עדי על מרווח 1 2 עד שהוא מתכופף ואז להסיר אותו. זה קשר אחד מהווה את אחד לדין.
5. תשובה חיובית מתרחשת כאשר חולדה מהר מעביר את הכף מן הגירוי. כיוון התנועה לעתים קרובות האחורי או חיצוני לפני איבר האחורית היא מכווצת. הנסיגה יש ליזום עד monofilament מוסר כדי לאשר את התגובה קשור ליישום monofilament.
6. החל monofilament 4.56 עוד פעמיים עם לפחות 30 שניות בין יישומים על מנת למנוע "קפיץ" חושי, כדי לאפשר את הקולטנים התחושתיים לחזור לקו הבסיס ירי לפני retesting (כדי למנוע הסתגלות).
7. הבדיקה הגירוי צריך ליישם מחדש אם תלושי VFH נוגע בעדינות את העור, מה שהופך את אספקת כוח יותר של צחצוח או לטאטא ולא קשר מחודד.
8. אם יש תגובות חיוביות פחות מ 2 (דהיינו 1 או 0) ועד monofilament 4.56, VFH הגדול הבא מוחל 3פעמים באותו אופן.
9. בדרך זו, VFHs בהדרגה יותר מ 4.56 עד 5.88 מוחלים עד שתיים או יותר תגובות חיוביות להתרחש או עד VFH הגדול ביותר הוא הגיע.
10. סף הנסיגה כפה הוא VFH הנמוך ביותר אשר מעוררת לפחות 2 תגובות חיוביות מתוך 3 ניסויים.
11. חזור על הכף האחרת.
12. הפגישה בדיקות בדרך כלל ניתן להשלים תוך 15 דקות שני הכפות האחוריות.

3. נציג תוצאות

ניסוי מוצלח תגרום לנסיגה, מהירה מיידית של כף רגל אחורית כדי VFH להחיל בניצב לאזור באמצע plantar (איור 1 א) או את פני השטח הגבי בין ¹ ו ^-2 כף הרגל 1 ס"מ מן המשותף (איור 1 ג) . תגובות אלה תאם להפיק סף מישוש על הכף בכל האחורית. סף מישוש של בדיקות VFH הגב ב SCI חריפה הראה אמינות מעולה עם ספי VFH plantar לגזורד עת כרוניות (איור 2). ירידות סף מישוש הנגזרות בדיקות plantar או הגב להתרחש SCI מדורג (איור 3 ^3,5). רגישות יתר זו באה לידי ביטוי כבר ב -7 ימים לאחר SCI ומתוחזק למשך הניסוי ^3-4,6. בעוד מגוון רחב של severities מדע אינם משפיעים על סף חושי מישוש הכף, ירידות ספי להתרחש SCI חמורה יותר (איור 3). חשוב לציין, את הפיתוח של allodynia מתחת ברמת היא התגובה הכל או לא זה מתרחש כאשר יש אובדן של למעלה מ -60% של החומר הלבן במוקד הנגע. (איור 4 ^3).

סף מישוש יכול ריקבון לייצר תגובות מלאכותיים לכוחות VFH נמוכים. לפחות שני תנאים יכול לייצר סף ריקבון - במהירות החלת VFH על העור באופן דוקר או יתקע או לא מחכה מספיק זמן בין יישומים גירוי. כדי להיות בטוחעל סף מישוש מקוריים, יש להקפיד ליישם כל VFH באמצעות גישה דומה מהירות נמוכה מרווח interstimulus חייב להיות לפחות 30 שניות. הראינו גם כי הרגלי אכילה מפחיתה את סף ריקבון ^5.

באיור 1. סכמטי ולצלם הצגת המיקום של גירוי VFH לבדיקה (VFH) plantar ואת הגב השיער פון פריי. א) בדיקות VFH plantar, שיער פריי פון יש להחיל בניצב hindpaw באמצע plantar כ 1 ס"מ האחורי כדי הפרק באמצע (בדיוק כמו בצילום של פני השטח הפלנטרי של hindpaw ידי התיבה אדום) בשעה איטי מהירות עקבית עד שהוא מתכופף. B ו-C) על הטכניקה VFH הגב, חולדה עטוף בצורה רופפת במגבת כירורגית כפי שמוצג בתמונה. VFH מוחל על פני השטח הגבי של הכף בין approximatel כף הרגל 1 ו 2y 1 הפרוקסימלי למפרק ס"מ.

באיור 2. הגב פון פריי שיער ספי החישה מתאם VFH plantar סטנדרטי. (N-44, מקדם פירסון = 0.503, p <0.01, R2 = 0.67). קווים מקווקווים להראות את סף הפסקת allodynic על התחושה באמצעות אחת VFH הגבי או טכניקות VFH plantar ואת עולה כי ספי allodynic ב -7 ימים לאחר SCI באמצעות מבחן VFH הגבי לחזות allodynia כרונית מתחת ברמת להעריך בשיטות VFH plantar.

איור 3. מוקדמים הגב פון ספי פריי שיער חושיות לחזות רגישות מישוש allodynic ולא allodynic פני severities פגיעה ב timepoints מאוחר יותר. ספי חישה דומים התרחשו בין 7 ימים הודעה VFH SCI הגבי ו 28 ימים הודעה אמצעים מדע VFH plantar. דמיון יוצא דופן התרחש על מגוון רחב של SCI, עם allodynia משמעותי ציין בינונית עד קשה SCI (עקירה p <0.05 1.1 מ"מ לעומת כל הקבוצות האחרות).

איור 4. אחוז חולדות שקיבלו laminectomy (ללא SCI) וקבוצות מדע מראה hindpaw allodynia לאחר 6 שבועות לאחר SCI. Allodynia היה לראות רק אצל חולדות עם מתונה או חמורה מדע (OSU מכשיר ESCID 0.9, 1.1, 1.25, 1.3 חוט התקות מ"מ) ואילו בחולדות עם SCI קלה (0.3, 0.5, 0.7 מ"מ התקות בעמוד השדרה) הוצגו תגובות נורמליות לגירוי חוש המישוש. נציג קטעים העטרה בעמוד השדרה מוכתמת על המיאלין במוקד הנגע עבור laminectomy (שליטה ללא פגע), קל (0.5 עקירה מ"מ), בינוני (1.1 עקירה מ"מ) וחמור (1.3 עקירה מ"מ) חבלות בעמוד השדרה נכללים להראות את מידת axonal חוסך המשויך רגישות יתר זו. (סרגל קנה מידה = 0.5 מ"מ).

k ">

איור 5. נתונים לדוגמה גיליון לבדיקה את השיער כלפי מטה פריי פון. ערך השיער התוצאה (חיובי או שלילי), נרשם עבור כל ניסוי. סימנים של מודעות supraspinal של בדיקות מצוינים. בתום הבדיקה, התגובות על כל ערך שיער נספרים. ערך הסף שנבחר עבור הנתונים הדוגמאות היא חגה.

Discussion

שיטות בדיקה VFH המוצג כאן מייצגים שתי פרדיגמות בדיקות הרגישים ותקפה לשימוש במודלים של עכברים מדע. חשוב לציין כי בדיקת הגב VFH נוצר להערכת ההתאוששות של תחושת מישוש של הכפות האחוריות בחריפות בעקבות באמצע החזה SCI כאשר חולדות אינם מסוגלים לעמוד על הרגליים האחוריות שלהם. פרדיגמה זו בדיקה עשוי לשמש גם כאשר חולדות להחזיר את היכולת לשאת את משקל גופן של הגפיים האחוריות צוואר הרחם לאחר SCI.

שתי פרדיגמות הפגינו כאן לנצל VFH מכויל כדי לקבוע את סף מישוש של כל כף רגל אחורית. שיטות אחרות לקבוע את התדירות של נסיגה או גירוי בלתי מזיק בדרך כלל או מזיק בדרך כלל. הראינו בעבר כי שיפורים קטנים סף מישוש עשוי לייצג את ההבדל בין נוכחות של כאב נוירופטי כרוני תחושת מישוש רגיל. לפיכך ניצול שיטות בדיקה ניסיונית הנובעים סף הכאב מאי facilitate תרגום של התערבויות טיפוליות פוטנציאליים למרפאה.

כמו עם כל בדיקות התנהגותיות, חובה לצמצם את מספר לערפלנים בתוך סביבת בדיקות שעשויות להשפיע על תוצאות מבחן התנהגותי ^9. לכן, חשוב כי כל פגישה בדיקות מתרחשת באותו זמן של יום, הטמפרטורה באותו חדר לחות מבוקרת. בנוסף, מאז חולדות תקשורת קולית בטווח קולי, חשוב כי חולדות הממתינים להיבדק נשמרים בחדר נפרד עד הבדיקה שלהם מתחילה. לנגפורד ואח' ¹⁰ הראו עדות דרמטית שבעלי חיים תמימים לחוות כאב לאחר שראה cagemate נחשף לגירוי מזיק. כדי להמשיך לחסל משונות בדיקות חושי המישוש, אנו מנצלים דגנים מסוכרים כמו מסיח הקוגניטיבית במהלך הבדיקה VFH plantar. בכך, אנו לייצב את התגובות של בעלי חיים. סף פחות סביר ריקבון לאורךבדיקות כאשר מסיח מסופק יותר כאשר הוא לא ^5. התייצבות זו היא כנראה עקב הרפיה של התנהגויות hypervigilant ו catastrophizing, שתי מדינות ציפייה שבו איום של כאב ופחד מפעילה מרכזים רגשיים במוח.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store