Summary
Een cyclische druk bioreactor in staat om onderwerpen hartklep tissue om fysiologische en pathologische condities druk is ontworpen. Een LabVIEW programma stelt gebruikers in staat om de controle druk omvang, amplitude en frequentie. Dit apparaat kan gebruikt worden om de Mechanobiologie van hartklep tissue of geïsoleerde cellen te bestuderen.
Abstract
De aortaklep, gelegen tussen de linker ventrikel en de aorta, zorgt voor unidirectionele bloedstroom, het voorkomen van terugstroming in het ventrikel. Aortaklep folders zijn samengesteld uit interstitiële cellen gesuspendeerd in een extracellulaire matrix (ECM) en zijn bekleed met een endotheelcellen monolaag. Het ventiel is bestand tegen een harde, dynamische omgeving en is voortdurend blootgesteld aan afschuiving, buiging, spanning en compressie. Onderzoek heeft aangetoond kalkvormende laesies in zieke afsluiters voorkomen in gebieden met een hoge mechanische stress als gevolg van endotheliale verstoring of interstitiële matrix schade 1-3. Daarom is het niet verwonderlijk dat epidemiologische studies een hoge bloeddruk heeft een leidende risicofactor bij het ontstaan van de aortaklep ziekte 4 getoond.
De enige behandelingsmogelijkheid die momenteel beschikbaar zijn voor ventiel ziekte is operatief vervangen van de zieke klep met een bioprosthetic of mechanische klep 5. Beter begrip van de afsluiter biologie in reactie op de fysieke belasting zou helpen ophelderen van de mechanismen van de klep pathogenese. Op zijn beurt kan dit helpen bij de ontwikkeling van niet-invasieve therapieën zoals farmaceutische interventie of preventie. Verschillende bioreactoren zijn eerder ontwikkeld om de Mechanobiologie van inheemse of aangelegde hartkleppen 6-9 te bestuderen. Pulsatiele bioreactoren zijn ook ontwikkeld om een waaier van weefsels waaronder kraakbeen 10, bot 11 en blaas 12 studiepunten. Het doel van dit werk was om een cyclisch druksysteem die kunnen worden gebruikt om de biologische reactie van aortaklep folders tot een verhoogde druk belasting toe te lichten te ontwikkelen.
Het systeem bestond uit een acryl kamer waarin om monsters te plaatsen en te produceren cyclische druk, viton membraan magneetventielen de timing van de druk cyclus controle, en een computer om elektrische apparaten te bedienen. De druk werd gecontroleerd met behulp van een drukopnemer, en het signaal werd geconditioneerd met behulp van een load cell conditioner. Een LabVIEW programma regelde de druk met behulp van een analoog apparaat aan met perslucht in het systeem op de juiste snelheid. Het systeem nagebootst de dynamische transvalvular druk die samenhangen met de aortaklep, een zaagtand golf produceerde een geleidelijke toename van de druk, typisch voor de transvalvular drukgradiënt die aanwezig over de afsluiter is tijdens de diastole, gevolgd door een scherpe drukval afbeelding van ventiel opening in systole. Het LabVIEW-programma konden gebruikers van de omvang en frequentie van de cyclische drukregeling. Het systeem was in staat om weefselmonsters onder fysiologische en pathologische condities druk. Dit apparaat kan worden gebruikt om ons begrip van hoe hartkleppen te reageren op veranderingen in de lokale mechanische omgeving te verhogen.
Protocol
1. Tissue Oogst en voorbereiding
- Aortaklep moet worden genomen bij volwassen varkens met een gewicht van niet meer dan 120 pond onmiddellijk na de dood.
- Was twee keer de kleppen met een steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en transport naar het laboratorium op het ijs.
- Alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden.
- Zorg ervoor dat geen folders geen enkel teken van degeneratie show, scheuren of verkalking. Verwijder folders uit de aorta wortel door te snijden 1 / 3 van de afstand van de annulus.
- Plaats folders in individuele putjes van een zes goed plaat en incubeer overnacht met 3 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium aangevuld met 1% anti-biotic/anti-mycotic oplossing en 10% foetaal runderserum bij 37 ° C en 5% CO 2.
- Als alternatief, geïsoleerde cellen kan worden gezaaid in zes-well kweekplaten en gebruikt in de druk-apparaat. Isolatie van de klep endotheliale cellen, en interstitiële cellen kan worden uitgevoerd zoals eerder beschreven 13, 14.
2. Druk Studies
- Een op maat gemaakte druk systeem is ontworpen om de mechanobiological effecten van de cyclische druk op de aortaklep weefsel 15 studiepunten.
- Meld u aan op de computer en open het LabVIEW-programma (figuur 1).
- Kalibratie:
- Voorafgaand aan de experimenten, moet het systeem goed worden gekalibreerd.
- Sluit de voeding aan op de printplaat. Dit levert stroom aan de magneetventielen die de stroom van lucht in en uit de kamer te controleren.
- Zorg ervoor dat de perslucht is aangesloten op het systeem en open de luchttoevoer naar volle snelheid.
- Zet het signaal versterker. Zorg ervoor dat de spanning te lezen is 0,00. Pas als nodig is
- De LabVIEW interface heeft een schakelaar met de vermelding "TEST / RECORD". Zorg ervoor dat de schakelaar is ingesteld op "TEST". Klik op de knop "Air Supply" aan de inlaat magneetventiel te openen.
- Met behulp van de gasdrukregelaar, onder druk van de kamer met perslucht op een PSI. De druk in de kamer kan worden gelezen met behulp van de digitale manometer bevindt zich op de achterkant-plaat van de kamer. Zodra de druk in evenwicht gebracht, nemen de spanning te lezen uit het signaal versterker. Herhaal dit voor 2, 3, 4 en 5 PSI.
- Construeer een kalibratiecurve van de druk ten opzichte van spanning. Druk moet worden omgezet van PSI naar mmHg. De vergelijking van de grafiek kan worden geplaatst in de code van het LabVIEW-programma
- Verwijder de aluminium frontplaat van de drukkamer en spuit de kamer met 70% ethanol. Verlof voor een minimum van 10 minuten om resterende ethanol dampen te verspreiden.
- Plaats de zes-well plaat met de folder monsters in de kamer en vervang de front-end plate. Zorg ervoor dat de afdichting luchtdicht door het aandraaien van de moeren op de vier draadeinden (gelegen op elke hoek van de eindplaat) met de hand. Plaats de drukkamer in de 37 ° C incubator. Een schematisch diagram van de drukkamer is weergegeven in figuur 2.
- De interface zal de gebruiker vragen om de hoeveelheid tijd die het systeem cycli tussen perslucht input en output te geven. Deze moeten worden ingesteld op 0.6s en 0.4s na te bootsen diastolische en systolische voorwaarden, respectievelijk bij een frequentie van 1 Hz. De gebruiker moet ook invoeren een gegevensbestand pad.
- In LabVIEW, klikt u op Uitvoeren en zet de "TEST / RECORD" toggle op "RECORD".
- Zorg ervoor dat de druk op het gewenste niveau met behulp van de grafiek op de LabVIEW interface. Druk kan worden aangepast met de gasdrukregelaar.
- Run-programma voor de gewenste lengte van de tijd.
- Zodra het experiment is voltooid, klikt u op de stop-knop op LabVIEW, schakelt u de luchttoevoer en opent de uitlaatklep van de drukkamer.
- Verwijder het front-end plate uit de kamer en op te halen zes-well plaat met samples. Monsters kunnen nu worden geanalyseerd voor genexpressie, eiwitexpressie, histologie, mechanische eigenschappen, etc.
3. Representatieve resultaten:
De druk systeem is in staat van het simuleren van de maximale transvalvular druk waargenomen onder normale bloeddruk, stadium I en fase II hypertensieve condities. Echter, de druk was niet in staat om de systolische drukgradiënt, die in wezen gelijk is aan nul in vivo na te bootsen. De frequentie wordt gehandhaafd op 1Hz, met een luchtinlaat tijd van 0.6s en een uitlaat tijd van 0.4s. Vertegenwoordiger druk golfvormen van normale en verhoogde druk voorwaarden verkregen uit het systeem is te zien in figuur 3.
Figuur 1: Scherm schot van de LabVIEW interface.
Figuur 2: Schematische tekening van de drukkamer A. isometrisch aanzicht van drukkamer; B. Zijaanzicht van drukkamer;C. Bovenaanzicht van de drukkamer.
Figuur 3: Grafiek van druk simulatie in de drukkamer bij (A) normotensieve, (B) Fase I hypertensieve, en (C) Fase II hypertensieve condities.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De druk systeem met succes blootgesteld aortaklep folders aan cyclische druk die representatief zijn voor de diastolische transvalvular druk. Het was echter niet in staat om de systolische druk transvalvular na te bootsen, als de druk alleen maar gedaald naar 40 mmHg. Transvalvular druk is het verschil tussen druk in de aorta ascendens en de linker hartkamer. Tijdens de diastole, wanneer de klep gesloten is, is het drukverschil 80mmHg onder normotensieve voorwaarden en 90 mmHg en 100 mmHg in stadium I en fase II hypertensie, respectievelijk. Tijdens de systole, wanneer de klep open is, het drukverschil tussen de linker ventrikel en de aorta ascendens is nul. De cellulaire veranderingen die optreden in de aortaklep ziekte worden verondersteld geassocieerd te worden met een hoge diastolische druk, dus, het feit dat de druk viel niet tot nul kunnen niet een groot probleem. Dit is gebaseerd op de veronderstelling dat hij onder druk omvang en niet onder druk amplitude, dat is de drijvende kracht achter de biologische reacties. Het verminderen van de druk van 100 mmHg tot 0 mmHg vereist 1.20 ± 0.04s, die gemeld zijn data-analyse van 20 onder druk cycli. Omdat de hoeveelheid tijd die de aortaklep is gesloten is ongeveer 2 / 3 van de hartcyclus, zou de instroom van lucht in de drukkamer nodig 2.4s tot dezelfde balans van de klep opening te maken en sluiten ervaren in fysiologische omstandigheden. Als gevolg daarvan zou een frequentie van 0,28 Hz worden gebruikt voor het testen van de effecten van zowel de systolische als de diastolische druk transvalvular verdiepingen op de aortaklep Mechanobiologie. Kan echter als zowel de systolische als de diastolische druk transvalvular te worden gesimuleerd met een fysiologische frequentie van 1 Hz, een vacuümpomp en reservoir worden gemonteerd op de uitlaat magneetventiel. De vacuümpomp kan worden ingesteld op een vast bedrag van druk, zodat verwijderen als de uitlaatklep opent, zou de hoeveelheid lucht die nodig is om volledig te verminderen de druk van de ingestelde drukniveau worden getrokken in het vacuüm reservoir. Het verwijderen van de druk die zou leiden tot een 0 mmHg omgeving, synoniem met een systolische transvalvular druk. Omgekeerd, wanneer de uitlaatklep sluit, zal het vacuüm niet meer van invloed op de kamer en zou de druk te verhogen via perslucht. Naast het gebruik van een vacuümpomp om dichter na te bootsen fysiologische omstandigheden, kan een uitlaatklep met een grotere diameter worden gebruikt om de druk in de bioreactor dalen sneller. Op dit moment, de 3 / 8 "diameter uitlaat magneetklep heeft een debiet van 3,3 liter per minuut (bij 60 ° C, soortelijk gewicht van 1); dat een uitlaatklep met een 2" diameter heeft een debiet van 28,0 liter per minuten. Een grotere diameter magneetventiel is meer kosteneffectief dan het gebruik van een vacuümpomp, maar het kan niet in staat om de druk volledig dalen tot nul te zijn binnen de fysiologische range en moet daarom verder worden onderzocht. Als alternatief zou een aantal magneetventielen worden geactiveerd door dezelfde controle circuit dat open gelijktijdig worden toegevoegd, waardoor "parallel processing" het gas uitstroom.
Het systeem kan worden bediend met behulp van continu in-house perslucht. Eerdere studies hebben aangetoond dat acute veranderingen in de gen-en eiwit-expressie kan plaatsvinden binnen twee uur 16, 17. Dit kan echter duur niet voldoende om van voorbijgaande aard gen / eiwit-expressie of veranderingen in de cellulaire fenotype studie als gevolg van mechanische stress. Het nadeel van het gebruik van perslucht is dat het gas niet bevat 5% CO 2, wat belangrijk is voor het regelen van de pH van het kweekmedium. Dit kan worden ondervangen door het toevoegen van HEPES buffer aan het medium. Ook cellen produceren CO 2 als een metabolisch afval product. Uitscheiding van CO 2 uit het weefsel wordt ook voorkomen dat het medium worden basic.
Naast het testen van aortaklep bij variërende drukken, kan het verstandig om de effecten van verschillende frequenties en te bestuderen. Kan bijvoorbeeld de effecten van veranderingen in de hartslag voor, tijdens en na de operatie toe te lichten veranderingen in eiwitexpressie in de klep. Postoperatieve ritmestoornissen optreden in tot 20% van de patiënten 18-21. Het LabVIEW programma dat wordt gebruikt voor dit systeem kan de gebruiker kiezen voor de lengte van de tijd de lucht binnenkomt en verlaat de kamer, dus de frequentie van de cyclus kan eenvoudig worden aangepast. Het apparaat zorgt voor een maximale frequentie van 1.5Hz (90bpm) als gevolg van de hoeveelheid tijd die nodig is om de druk uit de kamer uitlaat. Zoals te zien in figuur 3, een grote druk daling deed zich voor in de eerste 0,2 s na uitlaatklep activering, daarna geleidelijk af om de resterende druk voor de resterende 0,2 s van uitlaatgas. De gemiddelde drukval in de eerste 0,2 s van de uitlaat was 45,8 ± 0.34mmHg, gemeten over 20 druk cycli. Gezien het feit dat het testen van fase II hypertensieve voorwaarden alleen fietsen druk van ten minste 60 tot 100 mmHg vereist, een frequentie van 1,5 Hz 0.22s zorgt voor uitlaat, dat is voldoende time tot 40 mmHg van de drukval. Als een vacuümpomp is aangesloten op de uitlaat klep, kan het gemakkelijker een snellere daling van de druk en zou een hogere frequentie testen mogelijk te maken. De minimale frequentie van de bioreactor is niet beperkt, echter, omdat de druk regelaar kan leiden tot trage instroom van lucht en de uitlaatklep zou voldoende tijd om de drukval in de reactor te hebben.
Tot slot, heeft een steriele cultuur systeem is gebouwd om de ex vivo studie van de varkens aorta-hartklep Mechanobiologie mogelijk te maken. De druk in de bioreactor gefietst tussen de diastolische transvalvular drukniveaus voor fysiologische en pathologische omstandigheden. Om te voldoen aan de systeemvereisten, de bioreactor is compact en kan daarom worden opgenomen in een vochtige incubator om weefsel temperatuur op 37 ° C. Verder werden de druk omvang en frequentie onafhankelijk geregeld, waardoor een breed scala van voorwaarden die moeten worden onderzocht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
De auteurs zijn dank verschuldigd aan Shad Schipke en Daniel Chesser voor hun hulp bij het ontwerp en de fabricage van het systeem en Valtresa Myles voor hulp bij de voorbereiding van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| Dulbecco’s PBS | Sigma-Aldrich | D5652 | |
| Anti-mycotic/antibiotic solution | Sigma-Aldrich | A5955 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30070 | |
| Viton diaphragm solenoid valves | McMaster-Carr | 4868K11 | |
| Pressure Transducer | Omega Engineering, Inc. | PX302-200GV | |
| Load cell conditioner | Encore Electronics, Inc. | 4025-101 | |
| Data Acquisition (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
References
- Freeman, R. V., Otto, C. M. Spectrum of calcific aortic valve disease: pathogenesis, disease progression, and treatment strategies. Circulation. 111, 3316-3326 (2005).
- Robicsek, F., Thubrikar, M. J., Fokin, A. A. Cause of degenerative disease of the trileaflet aortic valve: review of subject and presentation of a new theory. Ann Thorac Surg. 73, 1346-1354 (2002).
- Thubrikar, M. J., Aouad, J., Nolan, S. P. Patterns of calcific deposits in operatively excised stenotic or purely regurgitant aortic valves and their relation to mechanical stress. Am J Cardiol. 58, 304-308 (1986).
- Agno, F. S., Chinali, M., Bella, J. N., Liu, J. E., Arnett, D. K., Kitzman, D. W. Aortic valve sclerosis is associated with preclinical cardiovascular disease in hypertensive adults: the Hypertension Genetic Epidemiology Network study. J Hypertens. 23, 867-8673 (2005).
- Cawley, P. J., Otto, C. M. Prevention of calcific aortic valve stenosis - fact or fiction. Annals of Medicine. 41, 100-108 (2009).
- Durst, C. A., Grande-Allen, J. K. Design and physical characterization of a synchronous multivalve aortic valve culture system. Ann Biomed Eng. 38, 319-3125 (2010).
- Engelmayr, G. C., Soletti, L., Vigmostad, S. C., Budilarto, S. G., Federspiel, W. J., Chandran, K. B. A novel flex-stretch-flow bioreactor for the study of engineered heart valve tissue mechanobiology. Ann Biomed Eng. 36, 700-712 (2008).
- Sucosky, P., Padala, M., Elhammali, A., Balachandran, K., Jo, H., Yoganathan, A. P. Design of an ex vivo culture system to investigate the effects of shear stress on cardiovascular tissue. J Biomech Eng. 130, 035001-03 (2008).
- Syedain, Z. H., Tranquillo, R. T. Controlled cyclic stretch bioreactor for tissue-engineered heart valves. Biomaterials. 30, 4078-4084 (2009).
- Lagana, K., Moretti, M., Dubini, G., Raimondi, M. T. A new bioreactor for the controlled application of complex mechanical stimuli for cartilage tissue engineering. Proc Inst Mech Eng H. 222, 705-715 (2008).
- Wartella, K. A., Wayne, J. S. Bioreactor for biaxial mechanical stimulation to tissue engineered constructs. J Biomech Eng. 131, 044501-044501 (2009).
- Wallis, M. C., Yeger, H., Cartwright, L., Shou, Z., Radisic, M., Haig, J. Feasibility study of a novel urinary bladder bioreactor. Tissue Eng Part A. 14, 339-348 (2008).
- Butcher, J. T., Nerem, R. M. Valvular endothelial cells regulate the phenotype of interstitial cells in co-culture: effects of steady shear stress. Tissue Eng. 12, 905-915 (2006).
- Metzler, S. A., Pregonero, C. A., Butcher, J. T., Burgess, S. C., Warnock, J. N. Cyclic Strain Regulates Pro-Inflammatory Protein Expression in Porcine Aortic Valve Endothelial Cells. J Heart Valve Dis. 17, 571-578 (2008).
- Schipke, K. J. Design of a cyclic pressure bioreactor for the ex vivo study of aortic heart valve mechanobiology. , Mississippi State University. Mississippi State. (2008).
- Smith, K. E., Metzler, S. A., Warnock, J. N. Cyclic strain inhibits acute pro-inflammatory gene expression in aortic valve interstitial cells. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. , (2009).
- Warnock, J. N., Burgess, S. C., Shack, A., Yoganathan, A. P. Differential immediate-early gene responses to elevated pressure in porcine aortic valve interstitial cells. J Heart Valve Dis. 15, 34-41 (2006).
- Brathwaite, D., Weissman, C. The new onset of atrial arrhythmias following major noncardiothoracic surgery is associated with increased mortality. Chest. 114, 462-468 (1998).
- Walsh, S. R., Oates, J. E., Anderson, J. A., Blair, S. D., Makin, C. A., Walsh, C. J. Postoperative arrhythmias in colorectal surgical patients: incidence and clinical correlates. Colorectal Dis. 8, 212-216 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Gaunt, M. E., Schneider, H. J. New arrhythmias after non-cardiothoracic surgery. BMJ. 7, 333-333 (2006).
- Walsh, S. R., Tang, T., Wijewardena, C., Yarham, S. I., Boyle, J. R., Gaunt, M. E. Postoperative arrhythmias in general surgical patients. Ann R Coll Surg Engl. 89, 91-95 (2007).
