Summary
وقد وضعت الرواية وكفاءة عالية من خطوتين تقارب بروتوكول اللوني ، ويوصف بالتفصيل. يستند هذا الأسلوب على علامة تنقية صغيرة مع اثنين من الصلات الكامنة وينطبق على طائفة واسعة من البروتينات الهدف مع خصائص مختلفة.
Abstract
نظرا للتكاليف العالية المرتبطة تنقية البروتينات المؤتلف البروتوكولات الحاجة إلى الترشيد. الإنتاجية العالية للجهود هناك طلبا على الطرق العامة التي لا تحتاج إلى البروتين الهدف الأمثل محددة 1. لتحقيق ذلك ، ويشيع استخدام العلامات تنقية وراثيا يمكن أن تنصهر في الجينات ذات الاهتمام 2. مؤشر تقارب الأكثر استخداما هو علامة سداسي الحامض الاميني ، الذي هو مناسبة لتنقية تحت كل الظروف المحلية وتغيير طبيعة 3. عبء الأيض لإنتاج علامة منخفضة ، ولكنها لا توفر ونوعية عالية ومنافسة تقارب 1،2 اللوني الاستراتيجيات القائمة.
هنا ، علامة تنقية bispecific مع موقعين ملزمة مختلفة على حمض أميني 46 ، وقد وضعت الصغيرة المجال البروتين. مشتق المجال الألبومين الملزمة من البروتين G العقدية ولها صلة قوية الأصيل في ألبومين المصل البشري(HSA). أحد عشر السطحية المعرضة الأحماض الأمينية ، لم يشارك في ألبومين ملزم 4 ، تم اختيارهم بصورة عشوائية وراثيا لانتاج مكتبة اندماجي. وأعرب عن مكتبة البروتين مع رواية مرتبة عشوائيا سطح ملزمة (الشكل 1) على جسيمات عاثية لتسهيل اختيار المجلدات عن طريق التكنولوجيا عرض فج. من خلال عدة جولات من biopanning ضد مثنوي Z - المجال المستمدة من البروتين والعنقوديات 5 ، صغيرة ، جزيء bispecific مع تقارب هائل سعيد أنعم على حد سواء ، وكان الهدف التعرف على رواية 6.
تم تقييم المجال البروتين الرواية ، ويشار إلى ABDz1 ، بوصفها علامة تنقية لمجموعة مختارة من البروتينات الهدف مع الوزن الجزيئي مختلفة ، والذوبان في نقطة تساوي الكهربية. وأعرب عن البروتينات الثلاث المستهدفة في القولونية Escherishia مع العلامة رواية تنصهر لمصطلحات - N وتنقيته بعد ذلك تقارب. أسفرت تنقية أولية في عمود إما مع أو يجمد HSA Z المجال في relatively المنتجات النقية. أسفرت اثنين خطوة تقارب مع العلامة تنقية bispecific في تحسن كبير من النقاء البروتين. ثبتوا مع وسائل الاعلام الكروماتوغرافي Z - المجال ، MabSelect سبيل المثال المؤكد أن تتوفر بسهولة للتنقية من الأضداد ، ويمكن بسهولة أن يقترن HSA كيميائيا إلى وسائل الإعلام لتقديم المصفوفة الثانية.
هذا الأسلوب هو مفيد خصوصا عندما يكون هناك ارتفاع الطلب على نقاء بروتين هدف استردادها. وbifunctionality العلامة يسمح لاستخدامها خطوتين الكروماتوغرافي مختلفة بينما يقتصر العبء الأيضي على المضيف التعبير نظرا لصغر حجم العلامة. ويوفر بديلا منافسا للعلامات ما يسمى اندماجي حيث تستخدم علامات متعددة في تركيبة 1،7.
Protocol
1. الاستنساخ من الانصهار هدف بناء gene/ABDz1-tagged
- إعداد شظايا PCR من الجين ABDz1 يحيط بها تقييد مواقع مناسبة لربط محطة N - من الجينات المستهدفة في التعبير بلازميد (أ ABDz1 تحتوي على البلازميد هو متاح مجانا من خلال اتفاق لنقل المواد).
- يلتصق المنقى ناقلات التعبير وشظايا PCR مع إنزيمات التقييد المختار في منطقة عازلة رد فعل مناسب. تنقية المنتجات قبل ربط.
- Ligate المقيد ABDz1 شظية في ناقلات التعبير التي تحتوي على جينات من الاهتمام وتحويل هذا المنتج إلى ربط E. القولونية (في الأسلوب الأصلي تم استخدام سلالة RR1ΔM15 8). انتشار الخلايا تحولت على لوحات أجار تستكمل مع المضادات الحيوية المناسبة للاختيار.
- PCR شاشة مستعمرات قليلة وتسلسل التحقق من الكاسيت التعبير الناجم عن تسلسل الحمض النووي.
- إعداد البلازميد من ثقافة بين عشية وضحاها من تسلسل verifالعبوات الناسفة وتحويل مستعمرة لسلالة التعبير المفضل (في كولاي E. الأسلوب الأصلي رشيد (DE3) ، تستضيف pRARE البلازميد لتحسين انتاج البروتينات المشفرة بواسطة الجينات البشرية ، وكانت تستخدم).
2. البروتين التعبير
- تطعيم مستعمرة بكتيرية واحدة في 10 مل من مرق الصويا تريبسيني تستكمل مع خلاصة الخميرة 5 جم / لتر والمضادات الحيوية المناسبة. احتضان عند 150 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- 1 مل من تطعيم الثقافة بين عشية وضحاها في المتوسط 100 مل جديدة وحفز بروتين تعبير (1 ملم أصلا الآيزوبروبيل - β - D - thiogalactoside عندما تستخدم فيه operon لبن) عندما تصل خلايا مرحلة النمو اللوغاريتمي.
- احتضان عند 150 دورة في الدقيقة عند 25 درجة مئوية خلال الليل الخلايا والحصاد عن طريق الطرد المركزي.
3. متعامد تقارب تنقية
- Resuspend الكرية العازلة في 25 مل تشغيل (25 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، و 200 ملي مول كلوريد الصوديوم ، EDTA 1 ملم ، 0.05 ٪ (W / V) 20 توين ، ودرجة الحموضة 8.0) وتعطيل عشره من قبل خلايا صوتنة في السعة 60 ٪ ، والبقول 1.0/1.0 لمدة 3 دقائق. الطرد المركزي العينة وتصفية البروتين تحتوي على هدف طاف (0.45 ميكرون) قبل تنقية أخرى.
- يوازن إما 1 مل العمود Sepharose HSA أو عمود NHS تفعيلها ، إضافة سابقا مع هائل سعيد أنعم وفقا لتوصيات المورد ، مع وحدات التخزين العمود 10 (CV) لتشغيل المخزن المؤقت في 1 مل / دقيقة على نظام تنقية البروتين مناسبة. تحميل lysate البكتيرية عند 0.5 مل / دقيقة وإعادة تعيين ثم معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة.
- يغسل العمود مع 5 السيرة الذاتية لتشغيل العازلة تليها 5 السيرة الذاتية لغسل العازلة (5 ملي NH 4 زينة ، ودرجة الحموضة 5.5).
- أزل العينة مع شطف العازلة (0.5 M HAC ، ودرجة الحموضة 2.5) في 1 مل / دقيقة وجمع الكسور ، وامتصاص عند 280 نانومتر رصد لتحديد الكسور من ذروة eluted نحو المزيد من التنقية.
- تجمع الكسور مع تركيز أعلى من البروتين ، مرتين في تمييع متأكد العازلة تشغيل (20 الفوسفات مم ، 150 مم كلوريد الصوديوم ، ودرجة الحموضة 7.2) وتأكد من درجة الحموضة في جميع أنحاء محايدة. إضافة 1 - M تريس الحموضة حمض الهيدروكلوريك 8 إلى زيادة درجة الحموضة إذا لزم الأمر.
- تحميل العينة عند 0.5 مل / دقيقة على عمود 1 مل MabSelect HiTrap التأكد من انه تم معايرتها مع 10 من السيرة الذاتية بالتأكيد العازلة على التوالي في 1 مل / دقيقة. إعادة معدل التدفق إلى 1 مل / دقيقة بعد التحميل.
- يغسل العمود مع 5 السيرة الذاتية لتشغيل العازلة متأكد (الخطوة 5) وأزل البروتينات مع HAC M 0.2 ، 2.7 درجة الحموضة. يمكن للبروتينات المستهدفة حساسة يتم تحييد شطافة مباشرة على الجباية إضافة تريس ، حمض الهيدروكلوريك.
يمكن إذا عكس الخطوات الكروماتوغرافي وشطافة من MabSelect أن تضعف العمود بالتأكيد في ادارة العازلة (الخطوة 3.1) ودرجة الحموضة ارتفع الى حوالى 8 باضافة 1 - M تريس حمض الهيدروكلوريك. بشكل عام ، يلاحظ أضيق الحدود القصوى عندما تستخدم مصفوفة من المؤكد في الخطوة الثانية.
4. تقييم النقاء الكهربائي بواسطة سلفات الصوديوم دوديسيل هلام بولي أكريلاميد (SDS - PAGE)
- تحميل الكسور على تنقيةخفض SDS - PAGE ، وإذا كان المطلوب ، وتحليل الوزن الجزيئي للمنتج يطهر قياس الطيف الكتلي. من المهم تماما للحد من العينة منذ السيستين الحرة في ABDz1 قد يسبب dimerization للمنتج تحت ظروف غير الحد.
5. ممثل النتائج :
كدليل على المبدأ ، وجرى تقييم متعامد تنقية تقارب يسرتها العلامة ABDz1 لمدة ثلاثة البروتينات البشرية تمثل الهدف الذوبان الطبقات المختلفة ، والأوزان الجزيئية ونقطة تساوي الكهربية (الجدول 1). وتنصهر وراثيا على جينات ABDz1 إلى الجينات المستهدفة وكانت أعربت عن ثوابت في كولاي ، ويبين الشكل 2 مخطط تدفق لجميع الخطوات في الأسلوب على التوالي. بعد تنقية بواسطة بروتوكول متعامد ، تم تحليل العينات التي تم جمعها في نقاط مختلفة من قبل SDS - PAGE (الشكل 3). النتائج تظهر بوضوح فائدة علامة مزدوجة وخطوتين تنقية محددة للغاية. على الرغم من نقاء معقول ميلانhieved بعد خطوة التنقية الأولية كما يرى من المواد الهلامية ، والخطوة المتعاقبة تعطي المنتج نقية جدا مناسب تماما للتطبيقات عالية تطلبا.
الشكل 1. تصميم مكتبة اندماجي المستخدمة لاختيار العلامة ABDz1 bispecific.
ال 46 حمض أميني طيات المجال الألبومين ملزم في حزمة مستقرة الحلزون الثلاثة وأنه يحتوي على موقع ملزمة للألبومين المصل الإنسان تقع في المقام الأول إلى الحلزون الثاني. بواسطة العشوائي وراثيا eleven سطح الأحماض الأمينية يتعرض الموجود في الحلزون الأول والثالث ، تم هندستها على سطح الرواية ملزمة. يشار إلى مواقف Eleven في هذا الرقم وفقا للترقيم آخرون Kraulis 9. biopanning التالية ضد ديمر من Z - المجال للبروتين العنقوديات واندماجي مع المكتبة وأعرب عن فج ، تم التعرف على bispecific ABDz1 الجزيء.
هو ligated A - PCR جزء يحتوي على تسلسل ABDz1 (N - عضال) مع الجينات ذات الأهمية في التعبير متجه مناسبة. يتم تحويل المنتج إلى ربط E. القولونية لتسلسل التحقق وإعداد البلازميد. بعد التحول إلى مضيف التعبير ، يتم تعيين ثقافة واسعة النطاق للتعبير البروتين المؤتلف من الثقافة حتى ليلة وضحاها الأولي. ويتم حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي والتي lysed صوتنة لإنتاج lysate البكتيرية التي تحتوي على البروتين الهدف. بعد خطوة الترشيح لإزالة الجزيئات الصلبة المتبقية ، يخضع لتنقية lysate تقارب متعامد على نظام مناولة السائل تمر خطوات تنقية اثنين في الخلافة. يتم أخذ عينات من كل القمم Eluted خطوات تنقية وتقييمها من قبل SDS - PAGE لتقييم ومقارنة النقاء رانه lysate قبل التنقية.
الشكل 3. SDS - PAGE تحليل البروتينات الهدف أعرب وتنقيته في الانصهار مع ABDz1.
تم جمع عينات مأخوذة من lysate البكتيرية من ثلاثة بروتينات المعبر عنها في الانصهار لABDz1 تمثل خصائص مختلفة ، والعلامة ABDz1 نفسها جنبا إلى جنب مع عينات من قمم المقابلة من تنقية على عمود هائل سعيد أنعم ، تليها MabSelect متأكد العمود (A) . 1-4 الممرات تمثل عينات من قبل lysates الممرات ، وتنقية 5-8 من تنقية HSA (الخطوة الأولى) والممرات 9-12 من تنقية MabSelect متأكد (الخطوة الثانية). يتم تحميل العينات في الترتيب التالي : 141377 - ABDz1 ، ABDz1 - HT875 ، ABDz1 - HT2375 وABDz1. بالإضافة إلى ذلك ، تم تحليل عينات تم الحصول عليها من نفس lysates المنقى بالترتيب العكسي على نفس الأعمدة (B). 1-3 الممرات تمثل عينات من قبل lysates الممرات ، وتنقية و 4-6ROM MabSelect متأكد تنقية (الخطوة الأولى) والممرات 7-9 من HSA تنقية (الخطوة الثانية). تم تحميل العينات في نفس الترتيب كما في (A) ولكن لم يتم تضمين العلامة نفسها. من هذه النتائج أنه من الواضح أن هذا الأسلوب خطوتين غلة البروتينات عالي النقاء بغض النظر عن الترتيب الذي يتم تطبيق الخطوات.
| اسم ب | الهدف من البروتين ج Uniprot | جزيئي الوزن (كيلو دالتون) | الذوبانية فئة د | الوزن الجزيئي الغرامي من الناتج الانصهار (كيلو دالتون) | نقطة تساوي الكهربية من الناتج الانصهار |
| 141377 | B7Z315 | 17.4 | 4 | 23.7 | 8.5 |
| HT875 | P01040 | 10.8 | 3 | 17.1 | 4.9 |
| HT2375 | P00740 | 8.9 | 5 | 15.2 | 6.8 |
- الوزن الجزيئي للABDz1 العلامة وحده هو 6.3 كيلو دالتون ، وأشر كهرساوي 6.7.
- البروتين المستهدف يمثل جزءا من البروتين Uniprot.
- http://www.uniprot.org .
- فئة ذوبان جزء من البروتين مع صاحب محطة N - 6 ABP 10.
الجدول 1. البروتينات المستهدفة والمنتجات الانصهار مع ABDz1 وضع علامة على تقييمها في الدراسة دليلا على المبدأ.
وقد تم اختيار ثلاثة بروتينات بشرية فريدة من نوعها مع الوزن الجزيئي مختلفة ، والذوبان في نقطة تساوي الكهربية وتنقية للتعبير عن نهج التقارب المتعامدة.
Discussion
تنقية متعامد تقارب بروتوكول المعروضة هنا يمكن تنقية فعالة لمجموعة واسعة من البروتينات الهدف. من خلال الجمع بين موقع المتأصلة ملزمة المجال الألبومين ملزمة مع سطح ملزمة الرواية ، وقد وضعت علامة صغيرة bispecific البروتين. انها واضحة جدا للاستفادة من البطاقات حيث يمكن ببساطة أن تكون مستنسخة ، وأعرب عن الانصهار في أي بروتين من مصلحة في أي ناقلات التعبير المفضل. ويمكن استخدام التجهيزات القياسية المتوفرة في معظم المختبرات لتنقية البروتين من خطوتين. لأن وظيفة العلامة ABDz1 يعتمد على طي الصحيح المجال لفضح لها بكفاءة سطحين ملزمة ، ويقتصر أسلوب للبروتينات المعبر عنها في شكل قابل للذوبان وغير مناسبة لتغيير طبيعة التنقيات في ظل ظروف. وينبغي أيضا خفض عوامل يمكن تجنبها لأنها تتداخل مع ربط ABDz1 إلى Z - المجال على مصفوفة MabSelect بالتأكيد.
متعامد تقارب purificaنشوئها يوفر بديلا مفيدا للأساليب التقليدية من أجل تلبية متطلبات عالي النقاء البروتينات الموجودة في العديد من التطبيقات تطلبا. في نفس الوقت ، هذا الأسلوب يلغي الحاجة لوضع علامات اندماجي عندما تستخدم استراتيجيات مختلفة في تنقية الخلافة. التطبيقات التي تتطلب البروتين الهدف الأصلي ، قد يكون عرض موقع تشطر البروتيني لجعل إزالة الأنزيمية للعلامة ABDz1 11 ممكنة. وعلاوة على ذلك ، العلامة ABDz1 هو أول bispecific المجال بروتين صغير ومطوية صفها حتى الآن. انها فريدة من نوعها نظرا لأنه يوفر استراتيجية تنقية الذي يعتمد على التفاعلات هدف الدرجتين تقارب محددة. في المستقبل سيكون من المثير للاهتمام أن توسيع هذا المفهوم من خلال وضع علامات bispecific الرواية التي تحمل السطوح الملزمة الجديدة التي تتوافق مع الراتنجات الكروماتوغرافي متوفرة وغير مكلفة. على سبيل المثال ، عن طريق استبدال الأحماض الأمينية المتورطين في الألبومين ملزمة مع بقايا الأساسية ، وعلامة متوافق مع طقد يكون التبادل اللوني على تحقيقه. وقد ثبت ان مفهوم مماثل فعالة عن طريق الهندسة المسؤول عن Z - المجال لتوليد العلامات المعروفة باسم حمض Z 12 و 13 Z الأساسية المتوافقة مع أنيون وتبادل الأيونات الموجبة ، على التوالي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا المشروع من قبل مؤسسة كنوت واليس والنبرغ ومجلس الأبحاث السويدي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Tryptic soy broth | Difco Laboratories | 211822 | |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212720 | |
| Vibra cell sonicator | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Former product | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
References
- Waugh, D. S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).
- Hedhammar, M. Protein engineering strategies for selective protein purification. CET. 28, 1315-1325 (2005).
- Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, 206-213 (1975).
- Linhult, M. Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin. Protein Sci. 11, 206-213 (2002).
- Nilsson, B. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein. A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).
- Alm, T. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).
- Nilsson, J. Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).
- Rüther, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).
- Kraulis, P. J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study. FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).
- Hedhammar, M. Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein. J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).
- Carter, P. Site-specific proteolysis of fusion proteins. ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).
- Hedhammar, M. Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery. PEDS. 17, 779-786 (2004).
- Gräslund, T. Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery. Protein Eng. 13, 703-709 (2000).
