Summary
Wir beschreiben die Verwendung von Perfluordecalin als infiltrative Eindeckmedium. Dies ist eine einfache Methode zur Verbesserung der Tiefe der Bildgebung in
Abstract
Das Problem des Erwerbs von hochauflösenden Bildern tief in biologischen Proben wird allgemein 1 quittiert. In luftgefüllte Gewebe wie die schwammige Mesophyll der Blätter der Pflanze oder Wirbeltier-Lungen weitere Schwierigkeiten ergeben sich aus mehrere Übergänge im Brechungsindex zwischen zellulären Komponenten, zwischen Zellen und Lufträume und zwischen dem biologischen Gewebe und der Rest des optischen Systems. Darüber hinaus führen Brechungsindex Missverhältnis zur Dämpfung von Fluorophor Anregungs-und Emissions-Signal in der Fluoreszenzmikroskopie. Wir beschreiben hier die Anwendung der Perfluorcarbon, Perfluordecalin (PFD), als infiltrative Imaging Medium, das optisch verbessert konfokaler (LSCM) Probenabbildung in der Tiefe, ohne auf schädliche Anstieg der Laserleistung und hat nur minimale physiologische Wirkung 2. Wir beschreiben das Protokoll für den Einsatz von PFD mit Arabidopsis thaliana Blattgewebe, die optisch komplexer als Ergebnis seiner istStruktur (Abbildung 1). PFD hat eine Reihe von Attributen, die es für diese Verwendung geeignet 3 machen. Der Brechungsindex von PFD (1.313) ist vergleichbar mit der des Wassers (1,333) und ist näher an der Cytosol (ca. 1,4) als Luft (1,000). Darüber hinaus ist PFD leicht verfügbar, nicht-fluoreszierenden und ist ungiftig. Die geringe Oberflächenspannung des PFD (19 Dyn cm -1) ist niedriger als die von Wasser (72 Dyn cm -1) und auch unter dem Grenzwert (25 bis 30 Dyn cm -1) für Stomata Eindringen 4, die es zu Überschwemmungen erlaubt das schwammige Mesophyll Lufträumen, ohne die Anwendung eines potenziell destruktiven Vakuum oder Tensid. Schließlich und vor allem hat PFD eine große Kapazität zur Auflösung von CO 2 und O 2, die den Gasaustausch in den überfluteten Gewebe aufrechterhalten werden, damit die Minimierung der physiologischen Wirkung auf die Probe ermöglicht. Diese Eigenschaften wurden in verschiedenen Anwendungen, die teilweise flüssige Atmung und Lunge Inflation sind benutzt wordenTION 5,6, Chirurgie 7, künstlichem Blut 8, Sauerstoffversorgung des Wachstums Media 9, sowie Studien über die Bildung von Eiskristallen in Pflanzen 10. Derzeit ist es üblich, Gewebe in Wasser oder wässrigem Puffer für Live-konfokale Abbildung montieren. Wir denken, dass die Verwendung von als Eindeckmedium PFD eine Verbesserung gegenüber der bisherigen Praxis dar und ermöglicht die einfache Herstellung von Live ganzen Blattproben für die Bildgebung.
Protocol
Das Protokoll gegeben unten beschreibt eine einfache Methode für die Verwendung von PFD als infiltrative Eindeckmedium in Arabidopsis thaliana Blätter, aber wir rechnen damit, dass diese Methode in einer Vielzahl von Anwendungen, bei denen bildgebende Luft-reichen Gewebe gewünscht wird, verwendet werden.
1. Montage Blattproben in PFD
- Bereiten Sie einen Objektträger mit einer gasdurchlässigen Dichtung aus Polydimethylsiloxan (PDMS, Carolina Observation Gel). PDMS ist ein viskoelastisches Polymer und kann geformt, um eine Kammer zugeschnitten auf experimentellen Anforderungen zu liefern.
- Äquilibrieren PFD mit Luft. Dies kann durch Einblasen von Luft oder durch Schütteln einem kleinen Volumen in einen mit Luft gefüllten Flasche PFD erreicht werden.
- Dekantieren PFD in eine offene Petrischale und Schwimmer eine ganze Keimling oder herausgeschnitten Blatt auf PFD für 5 Minuten. Das Gewebe sollte durchscheinend, erinnert an verglasten Gewebe (Abbildung 2 (a)). Blätter erscheinen dunkler oder heller als vor der Belichtung auf PFD, abhängigding auf den Lichtverhältnissen und dem Alter des Gewebes verwendet werden.
- Füllen Sie das PDMS Kammer mit Luft-äquilibriert PFD und sorgfältig Übertragung der Gewebeproben aus der Inkubation Petrischale auf die PDMS Kammer. Verschließen Sie die Folie mit einem Deckglas und Bild nach experimentellen Anforderungen.
- Hinweis: PFD auch gut in eine offene Kammer auf einem Deckglas gebaut oder in einer Perfusionskammer und ist kompatibel mit Silikonfett. PFD ist nicht kompatibel mit Teflon-Komponenten, wie es sie löst.
2. Repräsentative Ergebnisse:
Eine mikroskopische Untersuchung der PFD-inkubiert Blattproben zeigt, dass die Mehrheit der Lufträume überschwemmt werden. Abbildung 2 (b) zeigt Lufträume mit rekombinantem GFP in PFD ausgesetzt überflutet. Es ist offensichtlich, dass das Blatt nach Inkubation mit PFD ist überschwemmt, aber das gelegentliche Lufteinschlüsse bleiben kann. Wasser kennt keine Flut das Blatt unter diesen Bedingungen. LSCM von Proben inkubiert und montiert in einem ir-, Wasser-oder PFD zeigt, dass PFD einen Vorteil gegenüber Wasser und Luft in die Tiefe der Bildgebung möglich (Abbildung 3) gibt. Das Beispiel in Abbildung 3 angegeben zeigt Luft-, Wasser-und PFD montiert Arabidopsis Blättern ausdrücken cytosolically lokalisiert Venus, eine Variante des YFP 11, konstitutiv ist unter den 35S-Promotor exprimiert. Wir können sehen, einer ungefähr 2-fachen Anstieg in der Tiefe der Bildgebung beim Vergleich PFD und Wasser. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die genaue Verbesserung bei der Verwendung von PFD mit numerischen Apertur des Objektivs und der Art des Gewebes verwendet wird, variiert. Wir haben Plasmaströmung und Wurzel Haar Dehnung in PFD behandelt Sämlinge, jedes für gesunde Pflanzen zu sehen. Darüber hinaus haben wir 2 gezeigt, dass Fv / Fm, ein Maß für die Photosynthese Funktionieren der Pflanzen 12 in tolerierbaren Grenzen über Zeitskalen in der Bildgebung verwendet wird, bleibt.
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Abbildung 1. Pflanze Blatt Komplexität und optischen Auswirkungen
Schematische Darstellung, die den anatomischen Merkmalen der A. thaliana Blatt in Bezug auf die optischen Aufbau. Verwendete Abkürzungen sind obj. = Objektiv, imm. = Immersionsflüssigkeit, cov. = Deckglas, mnt. = Deckfluessigkeit, geschnitten. = Kutikula, ad. ep. = Adaxial Epidermis, st. = Stomata Pore, sp. = Schwammige Mesophyll, as = Luftraum, Kumpel. = Palisade Mesophyll, vb = Leitbündel, ad. ep. = Adaxial Epidermis. Die Zellwände werden durch schwarze Linien angedeutet.
Abbildung 2. PFD durchdringt leicht Arabidopsis Blättern
(A) Blätter in Luft, Wasser inkubiert oder PFD für 5 Minuten und aufgenommen mit einer Leica DCF3000FX Digitalkamera mit einem Leica-Mikroskop MZ16F (Leica Microsystems (UK) Ltd, Milton-Keynes, UK). Die JoVE Logo wurde auf Acetat-Folie gedruckt und beleuchtete herm unterhalb mit einem leichten Box. Die Belichtungszeit betrug 89 ms und alle Bilder wurden gesammelt und verarbeitet identisch. Scale-Balken 2 mm.
(B) PFD tragen gereinigten rekombinanten grün fluoreszierende Protein (GFP) begrenzt Lufträume in vivo. GFP ist falsch grün und rot wird verwendet, um Chlorophyll Autofluoreszenz, welche die Mesophyllzellen begrenzt zeigen. (Abbildung 2 (b) mit Genehmigung und voller technischer Details in Littlejohn et al. 2010 2). Scale-Balken repräsentieren 25 m.
Abbildung 3. PFD verbessert konfokale Bildgebung in den Blättern
LSCM Bilder zeigen zytoplasmatisch lokalisiert Venus-Fluoreszenz (grün) und Chlorophyll-Autofluoreszenz (rot) in intakten A. thaliana Blätter in Luft, Wasser oder PFD abgebildet. Die Anregungswellenlänge betrug 514 nm und Fluoreszenz-Emission wurde bei 518 nm aufgezeichnet 604 nm für Venus und 657 nm679 nm für die Chloroplasten. Jedes Panel ist eine einzige konfokalen Ausschnitt aus einer Z-Stapel von 11 konfokalen Bildern bei 5 um Abständen erworben genommen. Diese wurden von einer vollständigen Z-Stapel von 59 Bildern bei 1 um Intervalle, die verwendet wurden, um ergänzende Filme zu produzieren erworben extrahiert. Tiefe Messungen sind relativ zu den epidermalen Oberfläche. Repräsentative Bilder, die identisch verarbeitet wurden, werden angezeigt. Experimentelle Details wie Mikroskop-Einstellungen sind identisch mit denen in Littlejohn et al., 2010 2 gefunden. Scalebars repräsentieren 20 um.
Discussion
Dies ist eine einfache und leicht zu bedienen Technik Mikroskopie von luftgefüllten oder optisch komplexen Geweben zu verbessern. Wir haben gezeigt, dass die Technik einige starke Vorteile hat und wir hoffen, dass es verwendet wird, um biologische Fragen zu Luft-reichen Geweben aufzuklären. Zum Beispiel wäre es eine natürliche Wahl für die Untersuchung der Erreger Angriff in Anlage Mesophyll oder in der Lunge sein. Wir sind uns der Grenzen der Technik. Wir sind auf eine bessere Brechungsindexanpassung arbeiten, mit anderen Formen der Mikroskopie und Perfluorcarbon Deckfluessigkeit Nachschub während der langen Zeitskala Experimente verwenden. Wir erkennen auch an, aber, dass einer der Hauptvorteile von FKW, nämlich als biologisch inert hat eine Kehrseite. PFCs nicht gut lösen biologische Moleküle, die auch bedeutet, dass sie nicht einfach verwendet werden, um Verbindungen von Interesse wie Hormone, Medikamente und andere kleine Moleküle oder Ionen zu liefern.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Prof. Nicholas Smirnoff von der University of Exeter für seine Beratung und der University of Exeter Bioimaging Einrichtung bedanken. Die Finanzierung wurde von der britischen Biotechnology and Biological Sciences Research Council (Stipendium Referenz BB/E002682/1) zur Verfügung gestellt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Perfluorodecalin | F2 Chemicals | N/A | Telephone to order. |
| Carolina Observation Gel | Blades Biological | 13-2700 |
References
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