우리는 공촛점 현미경을 검색 레이저를 사용하여 살아있는 세포에 느리게 fluxes에서 신속하게 (마이크로초) 칼슘 이벤트를 분리하는 방법을 제시한다. 방법은 세포에 수백 픽셀의 기록 선 검사에 의한 칼슘 지표의 형광 강도 변화를 측정합니다. 히스토그램 분석은 우리가 다른 칼슘 fluxes의 시간 스케일을 분리 할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
Cardiomyocytes은 함수 1,2을 최적화하기 위해 함께 일할 시간을 변화의 여러 칼슘 2 + fluxes 있습니다. 칼슘 2에 변경 사항이 세포 요원에 대한 응답으로 + 활동은 주로 같은 아세틸콜린 3,4와 같은 에이전트에 의해 자극되는 플라즈마 막에화된 포스 포 라이 페이스 Cβ - Gα Q 경로에 의해 규제됩니다. 우리는 최근 caveolae 5,6 불리는 플라즈마 막 단백질 도메인이 Gα Q 7을 활성화 모함 수있는 것으로 나타났습니다. 이 함정 수사는 Gα Q의 활성 상태를 안정화하고 장기 칼슘 2 cardiomyocytes과 다른 세포 유형 8 + 신호를 발생하는 효과가 있습니다. 우리는 생활 cardiomyocytes의 빠른 규모로 역동적인 칼슘 반응을 측정하여이 놀라운 결과를 발견. 간단히, 세포는 형광 칼슘 2 + 표시와 함께로드됩니다. 우리의 연구에, 우리는 칼슘 2 + 그린 (Invitrogen에 사용칼슘 이온 결합에 따라 형광 방출 강도의 증가를 전시 C.). 형광 강도는 다음 공촛점 현미경 스캐닝 레이저 라인 스캔 모드를 사용하기위한 기록됩니다. 이 방법은 마이크로초 시간 스케일에서 시간 트레이스의 수백을 생산, 선택된 라인을 따라 픽셀 형광 강도의 시간 코스의 빠른 획득하실 수 있습니다. 이 매우 빠른 흔적은 Excel로 그리고 분석을 위해 Sigmaplot로 전송되며, 전자 노이즈, 무료 염료 및 기타 컨트롤에 얻은 성분에 비해 수 있습니다. 칼슘 2 해부하다 다른 흐름 속도 + 반응, 우리는 시간 픽셀 농도를 binned하는 히스토그램 분석을 수행했습니다. Binning은 스캔 500 성분 이상의 그룹의 우리를있게하고 하나의 플롯에 spatially과 temporally 컴파일된 결과를 시각화. 따라서 검사가 다른 피크 배치 및 소음에 의한 중첩 때 분별하기 어려운 속도가 느린 칼슘 2 +의 물결은 쉽게 볼 수있다binned histograms. 측정 시간 규모에서 매우 빠른 fluxes 더 칼슘이 반면, 매우 짧은 시간 용기의 농도의 좁은 분포를 보여 + 파도가 긴 시간 동안 용기 광범위한 배포와 binned 데이터를 보여줍니다. 이러한 서로 다른 시간 배포판은 우리가 세포에 칼슘이의 타이밍 + fluxes를 해부하다하고, 다양한 세포 행사에 미친 영향을 확인할 수 있습니다.
프로토콜
1. 칼슘 지표로로드 셀
- 35mm 유리 바닥 MatTek 요리의 플레이트 세포 (또는 챔버 스를 보는 다른 유리 바닥).
- 10μg/ml laminin과 함께하기 전에 실 일일 기본 myocytes 코트를 사용하는 경우. 킬로바이트 버퍼 (K - 반전 Tyrode 버퍼에 플레이트 심장 myocytes (어른 개, 신생아 쥐, 또는 다른 유기체에서 격리) 35 HEPES의 mmol / L, 140 KCl, 8 mmol / L KHCO 3 / 2 mmol의 mmol / L MgCl 2 L 및 0.4 KH 2 PO 4, 산도 7.5의 mmol / L)와 37 15% 태아 소 혈청과 1 % streptamycin와 0.5 % gentamicin과 부화로 보충 M199 중간에 점차적으로 그것을 변경 ° 5 % C CO 2.
- 또는 실온에서 30-45 분에 대한 원하는 표시 칼슘, 칼슘 녹색 AM (분자 프로브 1-5 μm의)와 세포를 품어. 염료의 photobleaching 피하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버.
- 14mM EGTA과 Leibovitz15 매체 (과 셀 세 번 씻으십시오낮은 칼슘 실험) 또는 적절한 보는 미디어를 수....
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토론
우리는 생활 cardiomyocytes의 급속한 칼슘 신호를 확인하고 격리하는 방법을 개발했습니다. 이러한 측정의 실험 조건이 이전에 다른 전지 시스템 10뿐만 아니라 cardiomyocytes 11 적용되었습니다 있지만, histograms 및 빈 분석의 사용은 많은 칼슘 2 + 이벤트 인수로 데이터를 수 있습니다. 빠른 이벤트가 쉽게 자신의 근본적인 메커니즘을 이해하기 위해 적응 느린 것들과 모델에서 격리 수 있습니다. Culturing의 cardiomyocytes는 많은 기본 셀 라인으로 어려울 수 있습니다. 그것이 일반적으로 세포가 취득한 후에 측정은 곧 이동해야한다는 생각이지만, 우리는 본 연구에서 사용되는 성인 송곳니 cardiomyocytes은 삼일 후 자신의 구체적인 속성을 잃기 시작하는 것으로 나타났습니다. 이 긴 시간 프레임은 세포가 단단히 세포가 같은 microinjection과 같은 잠재적으로 치명적인 치료를 살아남을 것입니다 할려고 기판에 부착하.......
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공개 사항
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
감사의 글
이 작품은 건강 보조금 2R01 GM53132 및 P50 GM071558 국립 연구소에 의해 지원되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약의 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
참고문헌
- Cheng, H., Lederer, M. R., Lederer, W. J., Cannell, M. B. Calcium sparks and [Ca2+]i waves in cardiac myocytes. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 270, 148-159 (1996).
- Cheng, H., Lederer, W. J. Calcium Sparks. Physiol. Rev. 88, 1491-1545 (2008).
- Rebecchi, M. J., Pentyala, S. N.
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재인쇄 및 허가
