Summary
우리는 공촛점 현미경을 검색 레이저를 사용하여 살아있는 세포에 느리게 fluxes에서 신속하게 (마이크로초) 칼슘 이벤트를 분리하는 방법을 제시한다. 방법은 세포에 수백 픽셀의 기록 선 검사에 의한 칼슘 지표의 형광 강도 변화를 측정합니다. 히스토그램 분석은 우리가 다른 칼슘 fluxes의 시간 스케일을 분리 할 수 있습니다.
Abstract
Cardiomyocytes은 함수 1,2을 최적화하기 위해 함께 일할 시간을 변화의 여러 칼슘 2 + fluxes 있습니다. 칼슘 2에 변경 사항이 세포 요원에 대한 응답으로 + 활동은 주로 같은 아세틸콜린 3,4와 같은 에이전트에 의해 자극되는 플라즈마 막에화된 포스 포 라이 페이스 Cβ - Gα Q 경로에 의해 규제됩니다. 우리는 최근 caveolae 5,6 불리는 플라즈마 막 단백질 도메인이 Gα Q 7을 활성화 모함 수있는 것으로 나타났습니다. 이 함정 수사는 Gα Q의 활성 상태를 안정화하고 장기 칼슘 2 cardiomyocytes과 다른 세포 유형 8 + 신호를 발생하는 효과가 있습니다. 우리는 생활 cardiomyocytes의 빠른 규모로 역동적인 칼슘 반응을 측정하여이 놀라운 결과를 발견. 간단히, 세포는 형광 칼슘 2 + 표시와 함께로드됩니다. 우리의 연구에, 우리는 칼슘 2 + 그린 (Invitrogen에 사용칼슘 이온 결합에 따라 형광 방출 강도의 증가를 전시 C.). 형광 강도는 다음 공촛점 현미경 스캐닝 레이저 라인 스캔 모드를 사용하기위한 기록됩니다. 이 방법은 마이크로초 시간 스케일에서 시간 트레이스의 수백을 생산, 선택된 라인을 따라 픽셀 형광 강도의 시간 코스의 빠른 획득하실 수 있습니다. 이 매우 빠른 흔적은 Excel로 그리고 분석을 위해 Sigmaplot로 전송되며, 전자 노이즈, 무료 염료 및 기타 컨트롤에 얻은 성분에 비해 수 있습니다. 칼슘 2 해부하다 다른 흐름 속도 + 반응, 우리는 시간 픽셀 농도를 binned하는 히스토그램 분석을 수행했습니다. Binning은 스캔 500 성분 이상의 그룹의 우리를있게하고 하나의 플롯에 spatially과 temporally 컴파일된 결과를 시각화. 따라서 검사가 다른 피크 배치 및 소음에 의한 중첩 때 분별하기 어려운 속도가 느린 칼슘 2 +의 물결은 쉽게 볼 수있다binned histograms. 측정 시간 규모에서 매우 빠른 fluxes 더 칼슘이 반면, 매우 짧은 시간 용기의 농도의 좁은 분포를 보여 + 파도가 긴 시간 동안 용기 광범위한 배포와 binned 데이터를 보여줍니다. 이러한 서로 다른 시간 배포판은 우리가 세포에 칼슘이의 타이밍 + fluxes를 해부하다하고, 다양한 세포 행사에 미친 영향을 확인할 수 있습니다.
Protocol
1. 칼슘 지표로로드 셀
- 35mm 유리 바닥 MatTek 요리의 플레이트 세포 (또는 챔버 스를 보는 다른 유리 바닥).
- 10μg/ml laminin과 함께하기 전에 실 일일 기본 myocytes 코트를 사용하는 경우. 킬로바이트 버퍼 (K - 반전 Tyrode 버퍼에 플레이트 심장 myocytes (어른 개, 신생아 쥐, 또는 다른 유기체에서 격리) 35 HEPES의 mmol / L, 140 KCl, 8 mmol / L KHCO 3 / 2 mmol의 mmol / L MgCl 2 L 및 0.4 KH 2 PO 4, 산도 7.5의 mmol / L)와 37 15% 태아 소 혈청과 1 % streptamycin와 0.5 % gentamicin과 부화로 보충 M199 중간에 점차적으로 그것을 변경 ° 5 % C CO 2.
- 또는 실온에서 30-45 분에 대한 원하는 표시 칼슘, 칼슘 녹색 AM (분자 프로브 1-5 μm의)와 세포를 품어. 염료의 photobleaching 피하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버.
- 14mM EGTA과 Leibovitz15 매체 (과 셀 세 번 씻으십시오낮은 칼슘 실험) 또는 적절한 보는 미디어를 수행하는 경우.
- Leibovitz15 중간 containing14mM EGTA 다른 30~45분에 대한 품어.
- 억제제의 효과를 테스트하는 경우 (예 : 10μM U73122 PLC 억제제) 두번째 부화하는 동안 그들을 추가할 수 있습니다.
2. Microinjecting 세포
- 24 유리 바닥 MatTek 요리 (또는 다른 볼 실)에 문화 cardiomyocytes.
- 14 MM EGTA과 페놀 무료 Leibovitz - 15 매체를 변경 (cardiomyocytes은 칼슘 무료 매체 주입해야, 다른 세포는 중간 들어있는 칼슘 주입 수 있습니다.)
- microinjection 솔루션을 준비 - 우리의 연구는 Gα Q를 제거하는 펩타이드를 사용 - caveolae 상호 작용. 볼륨에만 소량 세포 (~ FL)에 주입되고 있으므로 합리적인 농축 주식을 사용해야한다는 것을 명심하십시오. 우리는 칼슘없는 매체 DAPI이 펩타이드 2 μm의, Cav3 - 발판을 이용하였습니다. DAPI은 블루입니다E 염색되는 얼룩 핵 및 microinjected되었습니다 세포의 식별을 허용합니다. DAPI는 많은 칼슘 지표의 형광을 방해하지 않습니다. DAPI의 금액은 변수이고 우리는 일반적으로 (0.5과 2 μm의) 핵을 시각화하기에 충분한 사용
- 혼자 염료 추적기 - DAPI를 포함하는 제어 솔루션을 준비합니다.
- microinjections 자기 뽑아 또는 상용 바늘을 사용하십시오. 적절한 바늘 매개 변수를 결정하는 색소 분사로 연습합니다. 우리는 서로 다른 세포가 다른 바늘 직경 및 microinjection 압력을 필요로 수도 있습니다.
- 예를 들어 Eppendorf에서 FemtoJet 펌프 InjectMan NI2에 대한 자동 microinjection 시스템을 사용합니다. 90 사출 압력 P I 고전력 증폭기, 그리고 45 보상 압력 P C 고전력 증폭기를 설정합니다. 0.7로 사출 시간 t를 설정 S. 필요로 주입의 매개 변수를 정리하다.
- 거꾸로 현미경 (예 : 자이스 혈구 Axiove에 microinjections를 수행RT 200M)는 긴 작동 거리 위상 콘트라스트 목적 (예 : 공기 40x 2 단계 목표에 대한)를 갖추고 있습니다.
- 빠른 패션 가능한 많은 세포로 주입. 가능한 셀을 선택 위상 콘트라스트를 사용하여 주입 세포를 검사합니다.
3. 공동 연구 immunofluorescence
- PBS로 두 번 세포를 깨끗이 씻어 30 분 3.7 %의 paraformaldehyde로 고정시킨다. 필요한 경우, 전지가 고정되기 전에 자극 수 있습니다.
- PBS로 고정 셀에 세 번 씻어하고, 오분을 위해 PBS에 0.2 % NP40와 함께 품어.
- PBS는 일시간에 대한 4 % 염소 혈청 (또는 기타 적절한 혈청)이있는 사용 차단.
- 일시간 위해 PBS에 1 % 염소 혈청과 적절한 희석에 차 항체와 세포를 품어.
- 이러한 알렉사 - 형석 - 488 안티 토끼이나 알렉사 - 형석 - 647 희석 방지 마우스 차 항체로 형광 - 분류 이차 항체의 추가, 다음 150 MM NaCl, 25 MM 트리스, pH를 7.6로 10 분 동안 세포를 세 번 씻으십시오 1: PBS 1000 1 % 염소 혈청 (두 개의 다른 단백질에 대한 탐색시 기본 항체가 종에 제기해야하며 보조는 해당 종에 대한 있어야합니다.)
- 37 품어 ° C 일시간 들어, TBS로 세 번 씻는다.
- TBS 버퍼 또는 다른 적절한 보는 매체에 세포를 볼 수 있습니다.
4. 빠른 칼슘 이미징
- (예 : Fluoview 1000 올림푸스) 공촛점 현미경 스캐닝 레이저를 사용합니다.
- 높은 수치 조리개 목표를 사용하십시오.
- 인수 매개 변수를 설정합니다. 칼슘 녹색 사용 488 나노미터 여기와 긴 515 방사 필터를 전달합니다.
- 픽셀 시간을 조정 - 빠른 칼슘 측정을위한 2 μs / 픽셀로 설정합니다.
- 0.3 μm의 - 0.05의 픽셀 크기를 달성하기 위해 이미지 확대를 설정합니다.
- 특정 지역에서 선택의 세포에서 라인을 선택합니다.
- 시간 컨트롤러 창에서 시간 프레임을 원하는 얻으려면 적어도 1,500 스캔 (시간 획득을 선택응답 - 1.3 MS / 라인) 이초를 얻을 것입니다.
- 기록 배경은 이전에 자극에 반응 없음.
- 5 μm의의 carbachol와 세포를 자극하고 즉시 녹화 데이터를 시작합니다. 세포에게 Leibovitz15 매체의 한 ML에 보관, Leibovitz15 10 μm의의 carbachol를 준비하고 그릇에 부드럽게 한 ML을 추가
5. 데이터 분석
- 기록된 이미지에서 각 픽셀에 대한 농도의 압축을 풉니다. Fluoview 1000 소프트웨어를 사용하여 테이블로 강도 데이터를 저장합니다.
- Sigmaplot로 가져오기 강도 데이터 또는 유사한 데이터 분석 프로그램과 빈 ~ 90-40 방식으로 데이터입니다. 실험 및 전자 노이즈를 제어하는 비교.
6. 대표 결과 :
우리는 멀티 라인 레이저 여기와 40x/1.2 NA의 고차 색지움 물 침지 목적 갖춘 공촛점 현미경 LSM510을 (자이스 혈구, 예나, 독일) 스캐닝 레이저에 세포를 몇 군데. 그림. 우리가 distributio을 보여주 1 (빨간색)N이 세포 구의 주요 구조 단백질이다 caveolar caveolin - 3 항체로 고정하고 스테인드되었습니다 송곳니 성인 심실 cardiomyocytes에 caveolae니다. Caveolin - 3는 알렉사 - 647과 함께 immunolabelled과 그에서 633 - nm의 라인 흥분되었습니다 NE 레이저. 이미지 LP650 NM 방출 필터를 사용하여 기록되었다. caveolin - 3의 배포는 알렉사 - 488 (녹색)와 immunolabeled되었습니다 Gα Q에 비해되었습니다. 알렉사 - 488은 488nm 아르곤 이온 레이저 라인 흥분되었고 이미지가 BP505 - 530nm 방출 필터를 사용하여 기록되었다. 이러한 colocalization 측정에서 두 fluorophores는 멀티 트랙 인수를 사용하여 순차 방식으로 흥분되었습니다. 이 절차는 채널 간 이야기 최소화합니다. colocalization위한 데이터 분석 자이스 혈구 LSM510 - 메타와 함께 제공되는 AIM 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 볼 수 있듯이, 두 단백질이 colocalized 있습니다.
확인하는 방법에 caveolin - 3 Gα 사이의 커플링
검사의 각 라인은 칼슘 2의 농도 변동에 해당하는 + 그린이 142 μs 범위에서 찍은 71 포인트의 구성, 그리고 칼슘 응답 읽기 밖으로 신속한으로 사용할 수 있습니다. 예를 들어, 그림 인치 3 우리는 칼슘 2로 표시 칼슘 2 측정한 개인 cardiomyocyte의 단일 라인 + 활동 전에는 초 단위로 시간 함수 (위)로 후 + 녹색 형광 강도 (아래) 강화 5 μm의 제품 carbachol의 추가 세포내 칼슘 2 수준 + Gα Q - PLCβ 활동을 통해. 많은 라인이 평균 때, carbachol 자극은 칼슘 2 ~ 1.8 배 증가를 생산 + 그린 강도를. 실험 조건 변화 (상온, 레이저 파워 검출기 반응, 염료 배포판 등)으로 인해,이 증가는 개인에서 볼 수 없습니다라인 스캔합니다. 강도 값 (Y 축 값)이 유사하더라도, 그것은 바닥에 carbachol 자극 줄거리가 자극 전에 본적이 좁은 변동 봉우리보다 지속적인 칼슘 수준에 해당하는 많은 넓은 봉우리를, 그게 분명하다. 강도에이 확대와 상대적으로 상승 작고 느린 oscillations를 가린다. 우리의 목표는 더 나은 칼슘 변동 이러한 서로 다른 명백한 유형 간의 차별하는 것입니다.
이러한 빠른 칼슘 변동의 또 다른 예제는 그림에 표시됩니다. 4. 상단 그래프는 자극 심실 cardiomyocytes (적색) 및 3 라인 트레이스의 평균이 검정에 표시됩니다에 대한 원시 라인 데이터를 보여줍니다. 이러한 칼슘 변동이 Gα Q에 의해 중재되었다 그 범위를 확인하려면 - caveoline3 상호 작용을, 우리는 caveolin - 3 destabilizes 펩타이드 microinjected - 이상 칼슘 2 제거 Gα Q 상호 작용 (예 : Cav3 펩타이드) + 현재와 이러한 데이터를 파란색으로 표시됩니다(우리는 두 가지 성분이 더 잘 분별 수 있도록 Cav3 펩타이드의 농도에서 500을 빼는합니다.)
우리는 우리의 Excel 파일 Sigmaplot로 (Jandel 주식 회사)에서 원시 데이터의 열을 가져 히스토그램 분석을 실시. 이 분석에서는 이벤트의 번호는 히스토그램을 생성하기 위해 상자의 같은 숫자 (방식)로 분류됩니다. 빈의 너비 시간이 동일한 간격을 나타냅니다. 농도가 다른 시간에 삽입은 특정 빈의 높이가 적극성이 특정 시간 윈도우에서 발생하는 횟수를 나타냅니다 있도록 바인딩합니다. 이런 종류의 분석은 동일한 스캔 속도로 데이터를 수집에 따라 이후, 많은 흔적을 동시에 분석할 수 있습니다. 또한이 분석은 염색 수준의 차이, 레이저 파워 등, 전자 및 배경 잡음이 매우 빠른 시간 스케일에서 발생하는 구별하지 않습니다 오직 첫 번째 1-2 방식으로 볼 수 있습니다.
해당 histogra그림에있는 원시 데이터의 MS. 4 페이지의 하단에 표시됩니다. 제어 세포에 대한 히스토그램은 같은 레드 라인 (라인은 눈을지도를위한이며 모델이 가정되지 않습니다)에 의해 그려진 광범위한 시간 분포에 대응하는 방식의 다수에 걸쳐있다. 반면, Gα Q - Cav3 상호 작용은 펩타이드에 의해 방해되었다 세포의 반응에 대한 방식은 펩타이드의 존재가 더 이상 기간 fluxes를 제거 하자는 좁은 빈 배포에 국한되어 있습니다. Gα Q - Cav3를 방해하지 않는 제어 펩타이드의 Microinjection은 해제 주입 전지 8 유사한 히스토그램을 생산하고 있습니다.
그림. 5 우리는 + 성인 송곳니 심실 cardiomyocytes에서 그린 (왼쪽)와 신선한 칼슘 2의 빠른 강도 변동, caveolae을 (오른쪽)이 부족 unstimulated 쥐 신생아 cardiomyocytes을 비교합니다. 여기, 3 분 동안 농도의 해당 histograms은 binned되었습니다 35 느린 칼슘 이벤트를 볼 수 있습니다. 신생아 cardiomyocytes보다 체계적인 기준이 성인 세포에 대해 볼 수있는 동안 느린 칼슘 2 + 활동의 부족을 보여주는 평면 기준에 빠른 변화를 표시합니다. 이러한 차이는 대부분 쉽게 histograms에서 볼 수 있습니다.
Gα Q의 분포를 보여주는 송곳니 성인 심실 cardiomyocytes의 그림 1. 이미지는 알렉사 - 488은 488nm 아르곤 이온 레이저 라인과 이미지로 흥분했다 알렉사 - 488과 함께 immunolabeled는 BP505 - 530nm 방출 필터를 사용하여 기록되었다. 오른쪽 상단은에서 633 - nm의 라인과 함께 기쁘게 생각 알렉사 - 647과 함께 immunolabeled caveolin - 3의 로컬 리 제이션을보고 똑같은 그림이야 그 : Ne 레이저와 LP650 nm의 방사 필터를 사용하여 기록했다. colocalization가 오렌지색에서 볼 수있는 병합 이미지가 오른쪽으로 확장 이미지와 왼쪽 하단에 있습니다.
그림 2. 살고있는 개과의 성인 심실 cardiomyocyte의 칼슘 이미징은 칼슘 2 + 그린로드. 이미지가 488nm 아르곤 이온 레이저와 LP515 방사 필터를 사용하여 40x 목적으로 공촛점 스캐닝 레이저 현미경 시스템에 찍은 거예요. 이미지가 1200 라인으로 구성되어 있습니다, 픽셀 시간이 2 μs했습니다 머물러, 그리고 픽셀 크기 0.1 μm의되었습니다.
그림 3. 살고있는 개과의 성인 심실 칼슘 2 + 그린로드하고 설명 군데 cardiomyocyte, 그리고 하단 5 μm의 제품 carbachol의 추가에 의해 자극을 동일한 세포에서 라인 성분의 TOP 강도 변화.
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그림 4. 칼슘 2로드 살아있는 개과의 성인 심실 cardiomyocyte에서 라인 트레이스의 예를 들어 상위 3 트레이스의 평균은 검은 선으로 표시하고, microinjected되었습니다 세포에 비해 180 MS 점령 + 그린 (빨간색) 펩티드와 세 트레이스의 평균이 흑인에 Gα Q - caveolin 3 협회 (빨간색)를 방해. 우리보고를위한 데이터의 하위 집합에서 400 강도 계산을 빼는합니다. 하단 패널의 텍스트에서 설명한대로 binned 데이터의 해당 histograms이며, 빈 번호는 임의이며 빈 카운트 (또는 단순히 개수) 특정 병원에 강도의 합계 금액에 해당하는 경우. 우리는 통제 (왼쪽)와 펩타이드 (오른쪽) histograms에 그려진 라인 빨간색과 파란색 라인이 데이터를보다 쉽게 식별 및 비교 수 있도록하고 어떤 모델이 가정되지 않습니다.
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그림 5. 칼슘 2 강도 변동이 + 성인 송곳니 심실 cardiomyocytes에서 그린 (왼쪽)와 caveolae (오른쪽)와 해당 histograms 부족 신선한 unstimulated 쥐의 신생아 cardiomyocytes은 다음과 같습니다.
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Discussion
우리는 생활 cardiomyocytes의 급속한 칼슘 신호를 확인하고 격리하는 방법을 개발했습니다. 이러한 측정의 실험 조건이 이전에 다른 전지 시스템 10뿐만 아니라 cardiomyocytes 11 적용되었습니다 있지만, histograms 및 빈 분석의 사용은 많은 칼슘 2 + 이벤트 인수로 데이터를 수 있습니다. 빠른 이벤트가 쉽게 자신의 근본적인 메커니즘을 이해하기 위해 적응 느린 것들과 모델에서 격리 수 있습니다. Culturing의 cardiomyocytes는 많은 기본 셀 라인으로 어려울 수 있습니다. 그것이 일반적으로 세포가 취득한 후에 측정은 곧 이동해야한다는 생각이지만, 우리는 본 연구에서 사용되는 성인 송곳니 cardiomyocytes은 삼일 후 자신의 구체적인 속성을 잃기 시작하는 것으로 나타났습니다. 이 긴 시간 프레임은 세포가 단단히 세포가 같은 microinjection과 같은 잠재적으로 치명적인 치료를 살아남을 것입니다 할려고 기판에 부착하실 수 있습니다. 회사 첨부 파일이 중요합니다microinjection의 성공을 위해.
우리는 그들의 상호 작용을 방해 펩타이드를 microinjecting하여 칼슘 fluxes에 Gα Q - caveolin 3 협회의 역할을 확인. 우리는 microinjection은 세포와 세포 내용 누설 손상을 최소화하기 위해 매우 세심하게 수행되어야한다는 스트레스 싶습니다. 그러나 이러한 위험은 비교적 큰 cardiomyocytes로 소재의 적절한 금액을 제공하는 데 필요한 큰 직경의 바늘을 사용하여 균형을해야합니다. 하나는 세포가 microinjection되어 보유하고있는 추적할 수 있습니다 같은 DAPI로 염색의 포함은 중요하다. 언급했듯이, 그것은 microinjection의 myocytes을위한 칼슘 무료 매체와 주입 솔루션은 또한 칼슘 무료입니다 목욕을하는 것이 중요합니다. 세포외 칼슘의 유입이 수축과 세포의 후속 죽음을 시작
자신이 다른 세포 유형, 염료 및 공촛점 레이저 적응 수있는 측정칼슘 2 + fluxes는 확실 하나 가장 복잡한 세포 메신저 있지만 시스템은 이러한 insoitol 1,4,5 trisphospate 및 캠프 fluxes 등의 급속한 세포 이벤트를 따르십시오. 하나는 낮은 레이저 파워를 사용할 수 있도록 쉽게 photobleached하고 강력하고 역동적인 형광 반응을하지 않습니다 형광 표시기를 선택하는 방법에 대한주의하여야한다. 낮은 레이저 파워도 원치 않는 세포의 효과를 야기할 수있는 지역 난방을하지 않습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강 보조금 2R01 GM53132 및 P50 GM071558 국립 연구소에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 |
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