Assay Repliement intracellulaire

Résumé

Dans ce protocole, une méthode pour mesurer le repliement des protéines intracellulaires, après choc thermique est décrite. Cette méthode peut être utilisée pour étudier foldases comme chaperons moléculaires et leurs co-facteurs ou des composés capables d'influencer leur activité. Firefly activité luciférase est utilisée en tant que reporter pour mesurer l'activité de repliement chaperon.

Résumé

Ce protocole décrit une méthode pour mesurer l'activité enzymatique de chaperons moléculaires dans un système basé sur des cellules et les effets possibles des composés ayant une activité inhibitrice / stimulant. Chaperons moléculaires sont des protéines impliquées dans la régulation de repliement des protéines ¹ et ont un rôle crucial dans la promotion de la survie des cellules après les insultes de stress comme ^deux de choc thermique, la famine en éléments nutritifs et l'exposition aux produits chimiques / poisons ^3. Pour cette raison, les accompagnateurs sont trouvés d'être impliqués dans des événements comme le développement des tumeurs, chemioresistance de ⁴ cellules cancéreuses ainsi que la neurodégénérescence ^5. Conception de petites molécules capables d'inhiber ou de stimuler l'activité de ces enzymes est donc l'une des stratégies les plus étudiés pour ⁷ thérapie du cancer et les maladies neurodégénératives ^9. Le test décrit ici offre la possibilité de mesurer l'activité de repliement d'un chaperon moléculaire particulière et d'étudier l'effet de la maquetteounds sur son activité. Dans cette méthode, le gène de l'enquête chaperon moléculaire est transfecté avec une vecteur d'expression codant pour le gène de la luciférase de luciole. Il a déjà été décrit que dénaturée luciférase de luciole peut être replié par des chaperons moléculaires ^10,11. Comme normaliser le contrôle de transfection, un vecteur codant pour le gène de la luciférase Renilla est transfecté. Toutes les transfections décrites dans ce protocole sont effectués avec X-treme Gene ¹¹ (Roche) dans les cellules HEK-293. Dans la première étape, la synthèse protéique est inhibée par le traitement des cellules avec du cycloheximide. Par la suite, le dépliement des protéines est induite par choc thermique à 45 ° C pendant 30 minutes. Lors de la récupération à 37 ° C, les protéines sont à nouveau repliés dans leur conformation active et l'activité de la luciférase de luciole est utilisé comme lecture: plus la lumière sera produite, le plus de protéines auront regagné la conformation d'origine. Non-thermique cellules choqués sont fixés comme référence (100% des repliéeluciférase).

Protocole

1. Ensemencement des cellules

1. Avant de commencer, faites chauffer le milieu de culture, le PBS 1X et la trypsine dans un bain d'eau à 37 ˚ C
2. Prenez les cellules de l'incubateur et aspirer le milieu.
3. Appliquez doucement 5 ml de PBS 1X sur les cellules pour les laver.
4. Aspirer le PBS 1X et appliquer 1 ml de trypsine EDTA contenant 0,025%.
5. Tournez doucement la plaque pour avoir une distribution uniforme de la trypsine.
6. Placez les cellules dans l'incubateur à 37 ˚ C pendant 5-10 minutes (selon le type de cellule). Du temps de vérifier le temps si les cellules sont détachées en secouant la plaque.
7. Resus....

Discussion

Dans ce travail, un protocole visant à mesurer l'activité de repliement intracellulaire de chaperons moléculaires sont présentés. Le dosage de l'ensemble peut être réalisé en 3 à 4 jours comme indiqué par la vue d'ensemble sur la Fig. 1.

La robustesse et la linéarité du signal de la lumière produite par la luciole et la luciférase Renilla représentent une base solide pour la reproductibilité du protocole.

L'étape critique de l'.......

Matériaux

Pour cette expérience «Lumière Vector 'une forme Luminomètre Perkin Elmer '1420 compteur de luminescence a été utilisé

Programmes pour le luminomètre:

Renilla: Pompe 1, injection de 100 ul

Reaction Buffer: PUMP1, 70 d'injection ul

Luciférine: Pump2, injection 30μl

Pour les tampons préparer ces solutions de stock dans de l'eau bidistillée:

• - 1M MgSO _4: 246,48 g MgSO ₄ * 7H ₂ O dans 1 litre
• - 0,5 M EGTA: 190,18 g dans 1 litre d'EGTA
• - 1M KH ₂ PO _4: 136,09 g de KH ₂ PO ₄ dans 1 litre
• - 1M K2 HPO _4: 228,23 g K ₂ HPO ₄ * 3 H ₂ O dans 1 litre
• - NaCl 5M: 292,2 g de NaCl dans 1 litre
• - 0,5 M d'EDTA: 186,12 g EDTA * 2H ₂ O dans 1 litre  

GLY-GLY-tampon:

• - 25mm Glycylglycin
• - 15mm MgSO ₄
• - 4mm EGTA

Pour une utilisation litre 3,3 g de Glycylglycin, 15ml d'une solution 1M MgSO4 et 8ml d'une solution 0,5 M EGTA. Résoudre dans l'eau, ajuster le pH à 7,8 et porter à un volume total de 1 litre.

Tampon de réaction pour Renilla / coelentérazine mémoire tampon:

• - & Nbsp; 13,4 mM KH ₂ PO ₄
• - 86,6 mM KH ₂ PO ₄
• - 0,5 M de NaCl
• - 1mm d'EDTA

Pour une utilisation litres 13,4 ml d'une 1M KH ₂ PO _4, 86,6 ml d'une 1M K ₂ HPO ₄ solution, 100 ml d'une solution de NaCl 5M et 2ml d'une solution 0,5 M d'EDTA.

	Société	Catalogue / Numéro de produit:
DMEM (Dulbecco Modified Eagle Médium 1X)	GIBCO	41966029
Or le fœtus de sérum bovin	AAP	A15-151
X-treme Gene 9 Réactif de transfection d'ADN	Roche	06365809001
PBS Phosphate de Dulbecco saline tamponnée 1X	GIBCO	14190-094
MOPS 3 - (N-morpholino) propane sulfonique	SIGMA-ALDRICH	M1254
Cycloheximide	SIGMA-ALDRICH	C7698
Lysis Buffer 5X passif	Promega	E194A
Glycylglycin EGTA MgSO 4 (MgSO 4 * 7H 2 O)	SIGMA-ALDRICH Roth Roth	G7278 3054.2 P027.1
KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3 H 2 O) NaCl EDTA	Roth Roth Roth Roth	3904.1 6878.2 3957.1 8043.1
Luciférine Firefly	Biosynth	L8200
Coelentérazine	Biosynth	C7000
DTT (dithiothréitol)	Roth	6908.2
ATP (adénosine triphosphate)	Roche	10519987001