Isolamento ed espansione di cellule umane Glioblastoma Multiforme Tumore del saggio di neurosfere

Summary

Questo protocollo video dimostra l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali come da chirurgicamente asportato mutliforme glioblastoma umano (GBM) tessuti tumorali utilizzando il metodo neurosfere cultura test.

Abstract

-Come le cellule staminali sono state isolate nei tumori come mammella, polmone, colon, prostata e cervello. Un problema critico in tutti questi tumori, soprattutto in mutliforme glioblastoma (GBM), è quello di identificare e isolare popolazione di cellule tumorali di iniziare (s) per studiare il loro ruolo nella formazione del tumore, la progressione e le recidive. Tumore comprensione iniziare popolazioni di cellule fornirà gli indizi per trovare approcci terapeutici efficaci per questi tumori. Il test neurosfere (NSA) per la sua semplicità e la riproducibilità è stata utilizzata come metodo di scelta per l'isolamento e la propagazione di molte di queste cellule tumorali. Questo protocollo viene illustrato il metodo neurosfere cultura per isolare ed espandere cellule staminali, come in chirurgicamente asportato tessuto tumorale umano GBM. Le procedure comprendono una digestione iniziale dissociazione chimica e meccanica del tessuto tumorale e, successivamente, placcatura la sospensione risultante singola cellula in coltura NSA. Dopo 7-10 giorni, neurosfere primarie del 150-200 micron di diametro può essere osservato e sono pronti per un ulteriore passaging ed espansione.

Protocol

1. Raccolta di tessuto GBM primario

1. Un mutliforme glioblastoma (GBM) tumore è ottenuto da un paziente diagnosticato con il cancro e sottoposti a intervento chirurgico.
2. Accordi deve essere fatta con il team di neurochirurgia. Il neurochirurgo metterà GBM il tumore asportato in un tubo di dimensioni adeguate contenente cellule staminali neurali (NSC) medio basale completato con 10-15% di antibiotici (Peniciline / streptomicina). Medium freddo devono essere fornite alla sala operatoria da laboratorio. In alternativa, freddo HEPES-buffered medio minimo indispensabile (HEM) o tampone fosfato (PBS) con elevata concentrazione di antibiotici può essere utilizzato anche per questo scopo.
3. Il tessuto tumorale asportato viene consegnato al laboratorio su ghiaccio e posto sotto il cofano.

2. Dissociazione del tumore primario in cella singola Sospensione

1. Eccesso del mezzo originale / PBS è stato rimosso dal tubo falco e il campione viene lavato 2-3 volte con 5-10ml di PBS / NSC medio basale per rimuovere sangue e detriti. Il PBS / Medium è stato rimosso e il tessuto tumorale GBM è posto in una capsula di Petri.
2. Il tessuto viene tagliato in piccoli pezzi e macinata con una lama di 10 N. bisturi in piccoli pezzi per aumentare la superficie per il processo tripsinizzazione. Macinazione può richiedere 1-3 minuti a seconda delle dimensioni del tumore.
3. Il tessuto è trypsinized tritata in 3-5ml di pre-riscaldato 0,05% tripsina-EDTA per 10-15 minuti a bagnomaria a 37 ° C. Una pipetta elettronica è utilizzato per trasferire i pezzi tumore piccolo e tripsina in un tubo 15ml Falcon.
4. Un uguale volume di inibitore della tripsina di soia viene aggiunta per bloccare la reazione enzimatica tripsina dopo il periodo di incubazione.
5. Inattivazione della tripsina è assicurata pipettando la sospensione su e giù diverse volte. Poi, la sospensione è pellet dalla centrifugazione a 800 giri (110 g) per 5min.
6. Il supernatante viene scartato ed i pezzi di tessuto sono risospesi in 1 ml di soluzione sterile NSC basal media. Le macchie sono dissociate pipettando gentilmente su e giù (3-7 volte) fino a una superficie liscia sospensione lattiginosa singola cella è raggiunto. Il numero di passi pipettamento dipende direttamente dalla dimensione delle particelle nel tessuto tritato. Lungo e vigoroso dissociazione meccanica dovrebbe essere evitata in quanto potrebbe provocare la morte cellulare e una riduzione della formazione di sfera.
7. Per rimuovere un-dissociato pezzi e detriti, 10-15 ml di terreno di base viene aggiunto il tubo e la sospensione cellulare viene filtrata attraverso un filtro a 40 micron delle cellule in una provetta da 50 ml.
8. La sospensione è filtrata centrifugato a 800 giri (110 g) per 5min. Il supernatante viene scartato in seguito.
9. Pellettati cellule vengono poi risospeso in 1-2ml di completo supporto NSC per il conteggio delle cellule.

3. Conteggio delle cellule e placcatura

1. 10 ml di sospensione cellulare viene aggiunto a 90 ml di 0,04% tripan blu in un tubo di 1 ml Eppendorf.
   Nota: altre appropriato delle cellule diluizionezioni possono anche essere utilizzati.
2. Pipetta su e giù per miscelare la sospensione. 10 L delle cellule / trypan miscela blu è trasferito a emocitometro per contare la densità delle cellule.
3. Le cellule sono placcati in completo medio NSC (una miscela di media NSC basale e NSC supplemento di proliferazione nucleare in un rapporto 9:1) integrata con 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml e 1μl/ml dello 0,2% eparina (2μg/ml) in appropriato tessuto cultura navi. Ml 5, 20 e 40 di media è utilizzato per fiaschi T25, T80 e T175, rispettivamente. Gli antibiotici possono essere aggiunti al mezzo ad una concentrazione di 1:100 per diminuire la possibilità di contaminazione.
4. Il pallone viene posto in un incubatore a 37 ° C e 5% di CO _2.

4. Passaging e l'espansione del GBM sfere derivati:

1. Quando il neurosfere raggiunto una dimensione media di 150-200 micron di diametro, la cultura è pronto per sottocultura. Il contenuto di ciascun pallone viene rimosso e collocato in una dimensione appropriata TISS steriletubo cultura ue, e centrifugati a 800 giri (110 g) per 5 minuti a temperatura ambiente.
2. Il surnatante viene rimosso e il pellet viene risospeso in 1 ml di 0,05% tripsina-EDTA.
3. Per ottenere un tripsinizzazione ottimale, la sospensione cellulare viene incubato a 37 ° C a bagnomaria per 2-3 min. Per interrompere l'attività tripsina un uguale volume di inibitore della tripsina di soia viene aggiunta alla sospensione cellulare e la sospensione cellulare viene delicatamente pipettato su e giù.
4. La sospensione cellulare viene centrifugata a 800 rpm (110g) per 5 min. Poi, il surnatante viene rimosso e le cellule sono risospese in 1 ml di terreno NSC.
5. Un conteggio delle cellule viene eseguita come descritto in precedenza.
6. Le cellule sono placcati in una concentrazione di 5x10 ⁴ cellule / ml in totale medio NSC completato con fattori di crescita e placcato in vasi di dimensioni adeguate alla coltura di tessuti come descritto nella parte precedente.
7. Neurosfere secondarie si formano in 7-10 giorni, quando incubato a 37 ° C in ambienti umidiified incubatore con il 5% di CO _2.

5. Rappresentante dei risultati:

Dopo la placcatura singole cellule raccolte dal tessuto tumorale GBM, tumore-come le cellule staminali proliferare e generare piccoli gruppi di cellule composto da poche cellule in 3-4 giorni (vedi il video e la Figura 1). Come questi gruppi crescono, acquisiscono una forma più sferica in modo che entro 7-8 giorni, sfere in fase corretta luminoso con un diametro medio di 150-200 micron forma (Guarda il video e la Figura 2). A maggiore ingrandimento, sfere sano di solito dimostrare microspikes alla loro periferia. Avendo grande sfera come grappoli in 1-2 giorni dopo l'inizio della cultura è dovuta alla presenza di non dissociati aggregati al binging della cultura e non deve essere scambiato come sfere vero. La quantità di detriti nel campo del tumore primario cultura varia a seconda della fonte iniziale del tessuto e se non si include qualsiasi tessuto cerebrale circostante. La corretta tessuto tecniche di preparazionecompresi dissociazione enzimatica e meccanica, e successive di filtrazione del campione con una quantità sufficiente di media può portare a meno detriti nella cultura.

Figura 1. Primaria cultura sfera GBM 4 giorni dopo la placcatura. Tumore-come le cellule staminali proliferare e generare piccoli gruppi di cellule in 3-4 giorni. Ingrandimento originale; 20x.

Figura 2. Passage una cultura sfera GBM 8 giorni dopo placcatura. Ingrandimento originale; 20x.

Discussion

Per isolare staminali neurali e cellule progenitrici da adulto normale e il cervello del feto ^{1, 2, 3, 4} e anche tumore-come le cellule staminali dai tessuti tumorali come il polmone ^{5, 6} della prostata, della mammella e del cervello ^{7 8, 9} il test neurosfere è stato frequentemente utilizzati come metodo di scelta. Da questo test semplice e riproducibile, si può generare un numero indefinito di cellule dal tessuto tumorale asportato che mostrano caratteristiche simili a quelle delle cellule staminali somatiche; multipotenza ex vivo, la possibilità di creare nuovi tumori al momento dell'impianto, e di auto-rinnovamento. Queste cellule potrebbero essere usate per studiare la biologia di base delle cellule tumorali tra cui cellula-cellula interazioni, e la differenziazione, migrazione, invasione e morte cellulare. Inoltre, isolato tumore-come le cellule staminali di fornire uno strumento prezioso per studiare come si formano i tumori, il progresso, e la ricaduta e anche per svelare i meccanismi alla base derivanti cellulari che alla fine potrebbe fornire spunti per terapeuticoopzioni.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human)	Medium	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human)	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05753
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
**DNase I	Reagent	Roche Group	104159
**Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
No. 10 scalpel blade	Surgical tool	BD Biosciences	371610
Petri Dish	Culture ware	BD Biosciences	353003
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050-10
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.