Luz correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) como una herramienta para visualizar moléculas microinyección y sus objetivos eucariotas subcelulares

Resumen

La técnica CLEM se ha adaptado para analizar la morfología ultraestructural de las membranas, orgánulos, y estructuras subcelulares afectados por moléculas microinyectados. Este método combina las poderosas técnicas de micromanipulación / microinyección, microscopía fluorescente confocal y microscopía electrónica para permitir a milímetro resolución nanométrica múltiples. Esta técnica es viable para una amplia variedad de aplicaciones.

Resumen

La célula eucariota se basa en la compleja, altamente regulado, y los compartimentos de membrana ligados funcionalmente distintas que conservan una polaridad necesaria bioquímico para la correcta función celular. La comprensión de cómo las enzimas, proteínas, y componentes del citoesqueleto gobernar y mantener esta segregación bioquímica tanto, es de suma importancia. El uso de moléculas marcadas con fluorescencia para localizar y / o perturbar los compartimentos subcelulares se ha producido una gran cantidad de conocimientos y avanzar en nuestra comprensión de la regulación celular. Las técnicas de imagen tales como microscopía de fluorescencia confocal y hacer la determinación de la posición de una molécula de marcado fluorescentemente pequeña relativamente sencillo, sin embargo, la resolución de estructuras muy pequeñas se limita ^1.

Por otra parte, la microscopía electrónica ha revelado los detalles de la morfología subcelular a una resolución muy alta, pero su naturaleza estática hace que sea difícil de medir pro altamente dinámicoprocesos con precisión ^2,3. Así, la combinación de la microscopía de luz con el microscopio electrónico de la misma muestra, Light denomina correlativa y Microscopía Electrónica (CLEM) ^4,5, proporciona la doble ventaja de formación de imágenes ultrarrápida fluorescente con la alta resolución de la microscopía electrónica ^6. Esta poderosa técnica se ha aplicado para estudiar muchos aspectos de la biología celular ^5,7. Desde su creación, este procedimiento ha aumentado nuestra capacidad de distinguir las arquitecturas subcelulares y morfologías de alta resolución.

A continuación, presentamos un método simplificado para realizar la microinyección rápida seguida de CLEM (Fig. 1). El procedimiento de CLEM microinyección puede ser utilizado para introducir cantidades específicas de moléculas pequeñas y / o proteínas directamente en el citoplasma de células eucariotas y estudiar los efectos de un milímetro a la resolución de varios nanómetros (Fig. 2). La técnica se basa en la microinyecciónlas células cultivadas en cubreobjetos de vidrio grabado láser reticulados fijados a la parte inferior de platos y de formación de imágenes de células vivas con tanto microscopía confocal fluorescente y electrones. La localización de la célula (s) de interés se ve facilitada por el patrón de rejilla, que se transfiere fácilmente, junto con las células de interés, a la resina Epon utilizado para la inmovilización de muestras y corte antes del análisis de microscopía electrónica (Fig. 3). Superposición de fluorescencia y las imágenes EM permite al usuario determinar la localización subcelular, así como los cambios morfológicos y / o ultraestructurales inducidas por la molécula microinyectado de interés (Fig. 4). Esta técnica es susceptible de puntos de tiempo que van desde ≤ 5 s hasta varias horas, dependiendo de la naturaleza de la muestra microinyectado.

Protocolo

1. Cultivo de células mamíferas

1. Riñón de rata normal (NRK), inmortalizada cáncer de cuello uterino (HeLa), u otras líneas celulares de mamífero adecuadas se cultivan a 37 ° C, 5% de CO _2, en cubreobjetos de vidrio fotograbados reticulados fijados a vivir platos de células (véase la Tabla 1 para cualquier reactivo o aparato usado en este protocolo) en DMEM + 10% de FBS y 1% Pen / Strep. Se deben tomar precauciones para mantener un ambiente estéril cuando se trabaja con células de mamífero cultivadas.
2. Dependiendo de su experimental línea de tiempo (0-5 horas vs 1-2 días después de la inyección) la confluencia de....

Discusión

El método que aquí se presenta permite la entrega directa de las proteínas, ácidos nucleicos purificados, o pequeñas moléculas al citoplasma eucariótico y proporciona ultra alta resolución a través de análisis de la correlación de microscopía de fluorescencia y electrónica. El uso de este método es simple, pero robusto y se puede realizar en casa con muchas instalaciones de base existentes y / o debidamente equipados laboratorios de microscopía electrónica. La técnica es también sensible a la célula viva, lo que permite.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cubreobjetos Fotograbado y placa en vivo de células	MatTek	P35G-2-14-CGRD
Texas Red	Invitrogen	D3329
Cascada Azul	Invitrogen	D7132
Rodamina Etiquetado Kit	Thermo Scientific	53002
0,22 m unidad de filtración centrífuga	Millipore	UFC30GV00
Pipetas de vidrio de borosilicato	Sutter Instruments	BF100-50-10
Micropipetas Puller	Sutter Instruments	Modelo P-97	Utilice el programa n º 4 después de realizar la prueba de rampa
FemtoJet sistema de microinyección	Eppendorf	InjectMan NI2
Cubreobjetos líquido eliminación	MatTek	PDCF OS 30
Technai Microscopio Electrónico de Transmisión	FEI	Technai G2 BioTWIN
Ultramicrotombe	Leica	EM UC6