ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

サマリー

ヒトパピローマウイルスなどの局所感染を引き起こす病原体のT細胞エピトープを特性解析することは、血中に存在するT細胞数が限られているため困難です。本手法では、ごく少数の細胞から希少なT細胞を単離し、その特性を解析する方法について説明します。

要約

ヒトパピローマウイルス（HPV）などの局所感染を引き起こす病原体に特異的な、希少なT細胞の単離および特性解析における困難を克服するためのプロトコルが開発されました。その手順は、被験者からのT細胞エピトープを含むHPVタンパク質の領域の特定、インターフェロン-γ（IFN-γ）分泌に基づくペプチド特異的T細胞の選別、そしてT細胞クローンの増殖および特性解析です（Fig. 1）。被験者1は、生検により高グレード扁平上皮内病変と診断され、T細胞を採取した当日に治療のためLEEP（ループ電気切除術）を受けた患者でした¹。重複する合成ペプチドを用いて実施したIFN-γ酵素結合免疫スポット（ELISPOT）アッセイにより、ヒトパピローマウイルス16型（HPV 16）のE6およびE7タンパク質内でT細胞エピトープを含む領域を特定しました（Fig. 2）。このアッセイから得られたデータは、T細胞エピトープを含む領域の特定だけでなく、エピトープ特異的T細胞の数の推定、および市販の磁気ビーズ（CD8 T-cell isolation kit, Miltenyi Biotec, Auburn CA）を用いたIFN-γ分泌に基づく単離に使用されました。選別されたIFN-γ分泌T細胞は、1ウェルあたり1つのT細胞の増殖をサポートするため、照射したフィーダー細胞混合物の存在下で希釈し、単独で培養しました。これらのT細胞クローンは、必要となるT細胞クローン細胞数を最小限に抑えるため、特定された領域をカバーするペプチドおよび自己由来のEpstein-Barrウイルス形質転換Bリンパ芽球様細胞（LCLs、WallsおよびCrawfordの記述に従い取得）²の存在下で、IFN-γ ELISPOTアッセイを用いてスクリーニングされました。ELISPOTアッセイで通常用いられる1ウェルあたり1 x 10⁵個の細胞^1,3の代わりに、1 x 10⁵個の自己LCLs存在下で1,000個のT細胞クローン細胞を使用し、これにより必要なT細胞クローン細胞数を劇的に減少させました。自己LCLsは、T細胞クローン細胞にペプチドアンテゲンを提示するだけでなく、ウェル内の高細胞密度を維持することで、エピトープ特異的T細胞クローン細胞によるIFN-γ分泌を可能にする役割を果たしました。これにより、IFN-γ ELISPOTアッセイの確実な遂行が保証されます。同様に、IFN-γ ELISPOTアッセイを用いて、CD8 T細胞エピトープ（HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY）の最小および最適アミノ酸配列と、そのHLAクラスI制限要素（B58）を特性解析しました。また、HPV 16 E6またはE7タンパク質を発現するワクシニアウイルスに感染させた自己LCLsを用いてIFN-γ ELISPOTアッセイを実施しました。その結果、E6 T細胞エピトープが内因的に処理されることが示されました。さらに、他の高リスクHPV型の相同なT細胞エピトープに対する交差認識が示されました。この手法は、CD4 T細胞エピトープの記述にも利用可能です⁴。

プロトコル

被験者1から樹立したCD8 T細胞株を用いてIFN-γ ELISPOTアッセイを行った結果、HPV 16 E6の46-70領域にT細胞エピトープが含まれていることが判明し¹ (図 2)、本プロトコルの開始前に、IFN-γの分泌に基づいてエピトープ特異的T細胞が選別された (図 1)。

1. エピトープ特異的T細胞の限界希釈

1. 1%プールヒト血清を含む完全Yssel培地を用い、放射線照射（4,000 rad）した同種末梢血単核細胞（PBMCs）を5 x 10⁵ cells/ml、放射線照射（5,000 rad）した同種LCLsを5 x 10⁴ cells/ml、およびフィトヘマグルチニン（PHA）を0.1 μg/mlの濃度で混合し、フィーダー細胞混合液を調製する。なお、プロトコル全体を通して、細胞は無菌条件下で取り扱うこと。
2. 分離したエピトープ特異的T細胞（図 3）を、濃度が0.5 cell/100 μlまたは5 cells/1 mlになるまで、フィーダー細胞混合液を用いて連続希釈する。エピトープ特異的T細胞は約3 x 10³個を使用する。
3. マルチチャンネルピペッターを用い、希釈したエピトープ特異的T細胞を、合計30〜60枚の96....

ディスカッション

従来、免疫学者は、目的のT細胞をin vitroで刺激し、限界希釈実験を行ってエピトープ特異的なT細胞クローンを単離させることで、新規T細胞エピトープの特性解析を試みてきました。その後、クロム放出アッセイを用いてT細胞クローンの特性を評価していました^8,9。しかし、T細胞の頻度が低すぎて単離できなかったり、特性解析を完結させるのに十分な数のT細胞クローン細胞が得られなかったりしたため、多くの試みが不成功に終わりました。本手法では、(1) 目的のT細胞が十分な数存在するかを評価し、(2) IFN-γ分泌に基づいて選択することで目的のT細胞の頻度を高め、(3) 自家LCLをT細胞クローン細胞と共に播種するELISPOTアッセイを行うことで、少数のT細胞クローン細胞で解析を可能にし、これらの制限を克服しています。Fig. 2には、潜在的なT細胞エピトープが存在する領域の特定だけでなく、エピトープ特異的T細胞の頻度を評価するために行われたELISPOTアッセイの例を示しています。エピトープ特異的T細胞の推定数は、目的領域のスポット形成ユニットから、ペプチドなしの陰性対照の.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
CD8 T細胞分離キット	Miltenyi Biotec	130-094-156
フィトヘマグルチニン	Remel, Thermo Fisher Scientific	R-30852801	2mg/vial
Yssel’s medium	Gemini Bio Products	400-102	1% プールヒト血清
96ウェル丸底プレート	BD Biosciences	08-772-17
リコンビナントヒトIL-2	R&D Systems	202-IL-050	50μg
24ウェルプレート	Corning	07-200-84
リン酸緩衝生理食塩水	Cellgro	MT-21-031-CV
一次抗IFN-γモノクローナル抗体 (D1K)	Mabtech	3420-3-1000
ビオチン標識抗IFN-γモノクローナル抗体 (7B-6)	Mabtech	3420-6-1000
Multiscreen HA ELISPOTプレート	EMD Millipore	MAHA S45 10
ジメチルスルホキシド	Sigma-Aldrich	D2650	100 ml ボトル
プールヒト血清	Atlanta Biologicals	S40510H	熱不活化
RPMI 1640	Cellgro	MT-10-040-CV
Tween-20	Sigma-Aldrich	P2287-100ml
Vectastain Elite ABCキット	Vector Laboratories	NC9313719
安定化ジアミノベンジジン	Open Biosystems	MBI 1241
AID EliSpot Reader Classic	Autoimmun Diagnostika GmbH	ELR06