Summary
의 접종
Abstract
어렸을과 어린 시절에 얻은 Trypanosoma cruzi 급성 감염이 asymptomatic 보이지만 만성 감염된 가지 경우 약 삼분의 30 년 이상으로 Chagas 질병을 보여줍니다. Autoimmunity 및 기생충 지속성은 이론 Chagas 질병 1, 2의 pathogenesis를 설명하기 위해 경쟁하고 있습니다. Chagas 질병에 기생 지속성과 autoimmunity에 의해 연주 별도의 역할에 우리는 T.의 예방 수정된 달걀의 공기 챔버의 cruzi. 성숙한 닭 면역 체계가 T를 상대로 꽉 생물 학적 장벽입니다 cruzi 및 감염이 성장 3 첫 주 말까지 자사의 면역 체계의 발달에 따라 일으킬 수있는 요소들은 미리 제거한다. 병아리가 부화에 기생충이없는 있지만, 그들은 기생충 mitochondrial DNA kinetoplast (kDNA)가 자신의 자손으로 전송됩니다 자신의 게놈 내에 minicircle 통합 유지합니다. 닭 게놈의 kDNA minicircle 통합 문서 targ에 의해 얻은 것입니다eted 주요 꼬리-PCR, 남부 hybridizations, 복제 및 시퀀싱 3, 4. kDNA는 통합을 minicircle 파열 해독 및 면역 시스템 요인에 대한 열린 독서 프레임, 인산 가수 분해 효소는 (GTPase), adenylate cyclase와 phosphorylases (PKC, NF-카파 B 활성제, PI-3K)는 세포 생리학, 성장 및 분화 3, 5와 연관된 - 7, 및 다른 유전자 기능. effectors 세포 독성 lymphocytes에 의한 대상 심장 섬유의 거부로 인해 심한 심근염 인간 Chagas 질병에서 본 것과 유사한 염증성 심근증을 보여주는, kDNA 변이된 닭을 볼 수 있습니다. 특히, 심장 마비 및 골격근의 약점은 염색체 1 8의 dystrophin 유전자의 kDNA 파열로 성인 닭에 존재한다. 비슷한 genotipic 변경은 effectors CD45 +, CD8γδ + CD8α lymphocytes가 실시하는 조직 파괴와 관련된다. 따라서이 protozoan 감염 유전자 중심의 자기 면역 질환을 일으킬 수.
Protocol
1. 기생충의 성장
- T.의 trypomastigote 양식을 키운 cruzi Berenice와 β-갈락토-표현 Tulahuen T. murine 근육 세포의 cruzi MHOM/CH/00 C4 (L6)는 5퍼센트 10 % FSB, 100 IU / ML 페니실린, 100 μg / ML 스트렙토 마이신, 250 nm의 L-glutamin (산도 7.2)와 Dulbecco 최소한의 필수적인 매체 재배 37 CO 2 ° C. 뜨는 매체에서 자유 수영 trypomastigotes은 닭 계란을 예방하는 데 사용되었다.
- Leishmania braziliensis (LB) 20 % FBS으로 DMEM 재배 LTB300 주식을 성장. 기하 급수적인 성장 단계에있는 파운드의 promastigote 양식은 계란 9를 예방하기 위해 사용되었다.
2. 수정된 닭고기 계란에 기생충 접종
- 100 T.의 현탁액의 예방 cruzi 무대의 공기 챔버 위에 계란 껍질로 2 mm 직경의 구멍을 통해 배지 10 μl에 trypomastigotesX 비옥한 계란. 배아 세포로 악성 기생충 침략 및 복제는 비디오 S1에 표시됩니다. 제어 그룹은 다음과 같습니다) 제어 닭, B) 모의 제어 계란 배지 10 μl 수신, 배지 10 μl에 100 파운드의 promastigotes의 정지와 함께 주사 C) 스테이지 X 비옥한 계란 T.. cruzi와 LB는 kinetoplastid에 속합니다. 각각이 protozoans는 세포질 또는 호스트 세포 10 parasitophorous 공포에서 무료로 번식합니다.
- 접착 테이프로 구멍을 밀봉합니다.
- T.을 품어 cruzi에 감염된 계란과 모의와 감염되지 않은 컨트롤 샘플에서 37.5 ° C에서 21 일 동안 65 %의 습도.
- 삼 주 동안 32 ° C에서 24 H와 그 이후를 위해 인큐베이터에서 부화 병아리 보관하십시오.
3. DNA 추출을위한 구하기 샘플
- 말초 혈액 mononuclear 전지는 병아리에서 얻은되었습니다)T.에서 부화 cruzi 주사 계란, b)는 컨트롤, C) 배지 10 μl받는 mocks, D)를 LB 주사 계란에서 부화, 병아리에서 백혈구는 표준 프로토콜 11과 함께 따라 DNA의 추출을위한 처리됩니다.
- 수탉에서, 그리고 T.과 주사 계란에서 부화 암탉에서 수집한 unfertile oocytes (<5 ㎜)로부터 수집된 정액에서도 DNA를 추출 cruzi 및 제어 달걀 3, 4에서 부화 암탉에서.
- T.에서 kDNA을 추출 cruzi epimastigote 다른 곳에서 9 설명한 바와 같이, LB의 promastigotes에서, 또한 형성합니다.
4. 사용 Primers 및 프로브
PCR의 amplifications 및 열적 조건에 사용된 primers는 표 1에 표시됩니다.
남부 얼룩 hybridizations에 사용되는 프로브는 있었다 :
- 야생 형 minicircle이 (~ 1.4 KB) 푸리를 시퀀스T.부터 얘기 들이었다 cruzi epimastigote 양식;
- 나는 야생 형 kDNA의 소화 NSI 얻은 조각 (362 BP) Minicircle;
- 핵 DNA (nDNA) 반복 시퀀스 (188 BP) Tcz1 / 2 primers와 함께 기생충 DNA의 증폭에 의해 획득하였습니다. 프로브는 1% 아가로 오스 젤 3에서 정화되었다.
- LB의 promastigotes에서 야생 형 minicircle (~ 0.820 KB) 시퀀스.
5. PCR의 분석
- 감염된 병아리와 감염되지 않은 컨트롤의 게놈 DNAs으로 표준 PCR 프로 시저를 실행하고 T를 사용하여 조롱 cruzi nDNA Tcz1 / 2 12 kDNA는 s35/s36 13 primers. 또한 protozoan 특정 Lb3 및 Lb5 primers (표 1)를 사용 LB 감염된-달걀에서 병아리 부화의 게놈 DNAs으로 PCR을 실행합니다.
- 100 NG 템플릿 DNA, primers, 2 U DNA 형성 촉매 장치의 DNA 중합 효소 0.2 MM dNTP, 각 쌍 0.4 μm의와 1.5 밀리미터 MgCl과 반응 믹스 만들기
- 68 ° 72에서 C / 1 분 ° C 냉장하기 전에 5 분, 최종 확장자에서 95시 5 분, 30 초 30주기 ° C/30 초 동안 95 thermocycler 프로그램 ° C를 설정합니다.
- 로 표시된 특정 프로브와 하이브 리다이 제이션을위한 알칼리성 방법으로 긍정적 - 충전 나일론 막 (GE 생명 과학)로 전송됩니다 1.3 % 아가로 오스 겔에 증폭 제품 분석 [α-32 P] 임의 프라이머 라벨 키트 (Invitrogen을 사용 dATP , Carlsbad, CA).
6. 게놈 남부 Blots
- Mbo I 및 / 또는 에코 RI와 (Invitrogen) 신체 조직의 DNA 샘플에 통합 minicircles에서 하나의 상처를 효소를 사용하십시오.
- 감염되지 않은 컨트롤 병아리에서와 병아리의 다이제스트 유전자가 악성 T.과 주사 계란에서 부화 cruzi가 형성하고 있습니다.
- 제목 T.로부터 DNA의 소화 cruzi과치킨 시험 샘플에서 4 ° C. 50 V, 하룻밤의 0.8 % 아가로 오스 겔 전기 영동에의
- 긍정적으로 충전 나일론 막으로 구분하여 DNA 밴드를 전송합니다.
- 라디오 분류 kDNA 프로브와 DNA의 밴드 잡종.
- 65 15 분 동안 두 번 멤브레인 씻어 ° 2X SSC와 0.1 % SDS와 C 두 번 65시 15 분 대한 ° C ~ 0.2X SSC와 0.1 % SDS, 그리고 시간 변수 기간 동안 autoradiograph 각.
7. 프라임 꼬리-PCR을 타겟
- kDNA의 증폭에 2를 설정하는 구체적인 입문서로 kDNA의 primers를 결합한 수정 꼬리-PCR 기법에 의해 닭 게놈에 통합 minicircle 세 대형 PCR을 중첩주기, 그림 1에 표시된.를 구합니다
- 기본주기 : 각 반응은 200 NG 템플릿의 DNA, 2.5 밀리미터 MgCl 2, kDNA primers (S34 또는 S67)를 0.4 μm의 0.2 밀리미터 dNTPs, 2.5 U DNA 형성 촉매 플래티넘 (Invitrogen, Carlsbad, C를 포함). 별도로, GG primers (Gg1에 Gg6, 표 1)의 0.04 μm의와 함께 kDNA의 primers를 사용하십시오. 57.9에서 60.1로 온도를 설정합니다 ° kDNA primers 및 59.9에서 65.6까지 ° C CR-1 프라이머를위한 C #. 이러한 기온보다 높은 것을 참고 (~ 45 ° C)에 꼬리-PCR 10에 사용되는 임의의 퇴화한 primers를 위해 필요합니다. 온도 및 이전 논문 3에서 설명한 사이클 (MyCycle Thermocycler, 바이오 방사선 연구소, 헤라클레스, CA)를 사용합니다.
- 차주기 : 물에 기본주기 1시 40분 (V / V)에서 PCR 제품을 희석. kDNA primers S35과 S35 안티 센스 같은 GG를 primers와 함께 이전의 것들을 대체했습니다.
- 차주기 : 물속에서 보조 사이클 1시 10분 (V / V)에서 PCR 제품을 희석하고 별도로, S67 또는 S36 안티 센스와 함께 GG를 primers를 결합.
- 클론 직접 pGEM T 쉬운 벡터 (Promega, 매디슨, 위스콘신)보기 : PCR 차 사이클의 제품을 복제마지막으로 증폭의 제품은 것을 kDNA 프로브와 잡종.
- kDNA 프로브 및 시퀀스와 하이브리드화하여 클론을 선택합니다.
- T.에서 kDNA 300 PG의 혼합에 tpTAIL-PCR 유효성 검사 제어 조류의 DNA 200 NG와 cruzi는 kDNA에 노출하지 마십시오. 온도와 증폭 사이클이 시험 조류들의 DNA에 사용되는 동일합니다.
8. Chagas 질환 클리닉 발현
- T.부터 부화 병아리의 성장과 발전을 모니터링 cruzi 계란은 감염과 건강한 컨트롤의 사망률과 질병 발현을위한 주간 동안 매일 비 감염된 계란에서 부화.
- 이들 병아리의 임상 이상 (그림 2)를 감지하고 electrocardiograph (ECG) 녹음은 전기 축, 심장 arrhythmias 속도와 3을 평가합니다.
- 제목 kDNA - 변이 및 확대 수술 심실 유엔의 ECG 녹음에 매달 닭을 제어ipolar는 aVF (왼쪽 다리), aVL (왼팔) 및 aVR (오른팔)을 주도하고, 심장 확대 3 암시입니다, 왼쪽으로 평균 전기 축의 편차를 평가합니다.
9. 병리 및 Immunochemical 분석
- kDNA 변이된 병아리의 자연적인 죽음 이후에 기록 마음과 체중 인덱스 (그림 3). 같은 연령 및 성별의 제어 닭에도 인덱스를 구합니다.
- 심장, 식도, 내장, 골격근, 폐, 간 그리고 신장에서 섹션을 가져가라.
- 의 조직은 파라핀에 포함된 (산도 7.4) 10 % 포르말린 버퍼와 4 μm의 Hematoxylin-Eosin (HE) 염색법과 histological 분석 (그림 3)에 대한 두께 섹션에 잘라 수정.
- 배아의 수확 및 이등분 조직은 X-걸 - 얼룩에 β-갈락토을 표현 기생충과 주사 달걀, 대상에서 부화 9.
- 1 배아 조직의 나머지 절반을 고쳐서포르말린 0퍼센트, 산도 7.4 및 9.3 단계와 같이 진행합니다.
- 4μm 파라핀 얇은 임베디드 조직 부분을 잘라서 현미경 검사를위한 유리 슬라이드에 탑재합니다.
- 안티 T. 대한 인간 chagasic 항혈청 (1:1024 희석)와 X-걸 묻은 파란색 세포를 보여주 품어 섹션 cruzi 항원.
- PBS, 산도 7.4, 5와 순간은 각각 분 섹션을 씻으십시오.
- 플루오레신 - 복합 토끼 안티 - 인간 IgG와 두번째 부화하여 배아 조직의 파란색 셀을 청바지.
- coverslip으로 PBS (8 단계)로 마운트를 부분을 씻어과 T.을 colocalizing 위해 502 nm의 파장, 200x 배율,시 자외선 하에서 시험시 녹색 표시등 - 업 블루 세포를 관찰 배아 세포의 cruzi.
10. 심장 조직 손상의 표현형 면역 체계 세포
- kDNA - 긍정의 및 제어 kDNA 음수 병아리의 심장 조직 섹션의 표현형 면역 effectors 세포.
- 함께 슬라이드를 삽입5 분마다 100 % 70 % 크실렌에서 그리고 절대적인 에탄올 PBS에서 네번이나 세차장에 제출 이전에 왁스를 녹여 30 분 동안 65 ° C에서 파라핀에 포함된 조직 절을 참조하십시오.
- 증류수, 공기 건조에 슬라이드를 씻어하고 SouthernBiotech, 버밍엄, AL에서 얻은 특정 단클론 항체 (플루오레신 또는 R-phycoerythrin-복합 단클론 항체)로 취급합니다.
- 안티 닭고기 부-1 (부 1과 부-1의 B 대립 유전자 씨 70-75 kDa) Mab AV20 근친 병아리의 B 세포 항원에 monomorphic 결정자을 인식 마우스를 사용합니다.
- 안티 닭고기 CD45, 마우스를 사용 IG isotype IgM1 κ 치킨 thymus 가계 세포 (미스터 190 215 KDa 변종까지) 특정.
- 마우스를 사용하여 안티 - 닭고기 TCRγδ + (씨 90 kDa의 heterodimer) Mab thymus 의존 CD8α + T 세포가 특정.
- 안티 닭고기 Mab가 CD-8 닭고기 α 사슬 (씨 34 kDa)에 구체적 주년을 인식 마우스를 사용하여thymocytes, 비장, 심장 및 기타 조직에서 전자 CD8 세포.
- 독점적 식세포 시스템의 monocytes / macrophages을 인식 마우스 안티 치킨 KuL01을 사용합니다.
- 0.1 M PBS, pH를 7.4, 5 분 습한 실내에서 90 분, 특정 안티 표현형 항체 각각 후에 부화와 슬라이드를 세 번 씻는다.
- 빨간색과 녹색 형광 라벨이 표시된 세포 (그림 4) 검색하는 각각 발광 파장 567의 필터와 502 nm의와 형광등 현미경 검사를위한 버퍼 글리세린과 함께 슬라이드를 조립.
11. 데이터 분석
- 닭 게놈 데이터베이스 (사용 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/seq/BlastGen/BlastGen.cgi?taxid=9031을 BLASTn 시퀀스 분석을 위해).
- 전자 가치 점수를 결정하는 CLUSTALW 정렬을 사용합니다.
- GI를 직원으로 고용RI 반복 마스킹 알고리즘 (검열 http://girinst.org/censor/index.php 키메라 시퀀스의 반복의 다양한 클래스의 지방화를 위해).
- WU-Blastn으로 수정한 매트릭스 3의 도움으로, kDNA 시퀀스에 잠재 gRNAs를 식별할 수 Kinetoplastid 삽입 및 삭제 시퀀스 검색 도구 (키스)를 직원으로 고용하고 있어야합니다.
- T. 사용 cruzi 시퀀스 http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471- 2164-8-133-s1.fas kDNA-호스트의 DNA chimeras의 gRNAs 검색 기능을합니다. 11.6)를 사용하여 학생의 T와 실험 및 제어 그룹에서 얻어진 전기 축의 편차 사이 마음 / 몸 체중 인덱스 사이의 큰 차이를 감지하고, 사망률 비율에게 부화 병아리의 그룹 사이에 큰 차이를 감지하기 위해 각각 Kolmorov - 스미 르 노프 검사, T.의 cruzi 전계란 noculated와 컨트롤에서.
12. 대표 결과
100 악성 T.의 접종 비옥한 닭고기 달걀의 공기 챔버로 cruzi의 trypomastigotes 살아 부화 새끼의 상당히 비율을 감소하지 않습니다. 약 60 %가 건강한 새끼를 부화 40 %는 부화에서 배아 액화 또는 배아의 죽음을 받다 수 있습니다. 살아남은 새끼들은 게놈에 통합 kDNA의 minicircle 순서를 유지합니다. 그러나, 그것은 어떤 새끼가 부화 후 몇 주 동안 cardiomegaly과 실패로 죽을 것으로 예상된다. 남은 새끼들은 겉으로는 건강한 성인으로 성장할 것이다. 삶의 모든 단계에서 자신의 혈액 mononuclear 세포에서 추출한 DNA는 kDNA의 PCR 증폭을 양보했지만 nDNA하지 않습니다. 타겟팅 - 프라임 테일-PCR 3, 4 복제되고 제품과 순서는 kDNA가 5 macrochromosomes 1의 영역을 코딩에서 주로 통합 minicircles 표시됩니다. 여러 kDNA에게 I를 보여주는 병아리세포 성장 및 분화, 면역 시스템 조절 인자 및 DNA를 수리 코딩 유전자로 ntegrations 자기 대상 조직 (그림 3)의 거부를 받아야하는 후보입니다. 예를 들어, 세포막에 cytoskeleton에 바인딩 단백질을 코딩, dystrophin 유전자 (그림 5)의 파열과 함께 kDNA 변이를 보여주는 닭고기 면역 염증 심근증과 실패를 개발 후보입니다.
이러한 게놈 수정은 LB 감염된 달걀에서 부화 새끼로 볼 수 없습니다. T. 차이가 있습니다 cruzi 및 LB kDNA minicircles, T. 네 변수 지역 (VR)과 cruzi K 유전자 minicircle 평균 1.4 이하 구조는 CA 풍부한 구부러진의 DNA 복제의 개시에 대한 특정 사이트로 간주되는 보존되어 각 CSB1을 보여주고 지역 (CR), CSB2 및 CSB3 지역, 전사에 의해 interspersed 재조합, 그리고 측면의 DNA 전송을위한
| 뇌관 | 대상 DNA | 순서 | TM * |
| S 34 | T. cruzi kDNA | 5 'ACA CCA ACC CCA ATC GAA CC 3' | 57.9 |
| S 67 | T.cruzi kDNA | 5 'GGT TTT GGG AGG GG (G / C) (G / C) (T / G) TC 3' | 60.1 |
| S 35 | T. cruzi kDNA | 5 'ATA ATG 전술 GGG (T / G) GA GC GAT 3' | 59.4 |
| S 36 | T. cruzi kDNA | 5 'GGT TCG ATT GGG GTT GGT G 3' | 57,9 |
| Lb3 | LB kDNA | 5 'GGG GTT GGT GTA ATA TAG TGG G 3' | 55.9 |
| Lb5 | LB kDNA | 5 'CTA AT & T는 GTG CAC GGG의 개그 G 3' | 61.4 |
| GG 1 | gallus Gallus | 5 'AGC TGA TCC TAA AGG 편대의 편대 장 AGC 3' | 60.1 |
| Gg2 | gallus G. | 5 'CTG AGC CTC TGCTTT GAA 3 ' | 56.8 |
| Gg3 | gallus G. | 5 'TTT CAA AGC AGA GGC TCG G 3' | 60.1 |
| Gg4 | gallus G. | 3 'GCT CTG CCT GGA TCA TTA GCT 5' | 64.2 |
| Gg5 | gallus G. | 3 'AGC AAC TCA GCG TCC ACC TT 5' | 62.3 |
| Gg6 | gallus G. | 3 'CTG TTA GCA GGC TGA TTC ACA 5' | 60.4 |
표 1. Primes는 PCR Amplifications에 사용된다. * TM = 평균 어닐링 온도 ° C.
그림 1. TP 꼬리-PCR 전략 Gallus gallus 게놈에 Trypanosoma cruzi kDNA 통합을 감지하는 데 사용됩니다. ) kDNA의 조각과 키메라 시퀀스 닭고기 10 게놈 (녹색)의 염색체 4 (AY237306)에서 현장 NW_001471687.1에 통합 보존 (진한 파란색)와 변수 (하늘색) 지역 minicircle 것은 호스트를 얻기 위해 사용되었다 특정 프라이머 세트 (Gg1에 Gg6). B) TP 꼬리-PCR의 amplifications는 닭 고유 Gg1에 Gg6 primers와 함께 minicircle 특정 S34 또는 S67 primers의 어닐링에 의해 (주 사이클) 시작되었다. 희석 제품은 S35 (감각 / 안티 센스) primers와 GG의 primers의 조합과 함께 보조주기위한 템플릿을 제공했습니다. 차주기의 보조 제품의 희석은 GG의 프라이머와 함께 kDNA S36 또는 S67 안티 센스 primers로 증폭를 받게되었다의. C)이 증폭 제품은 1퍼센트 아가로 오스 젤로 분리되어 나일론 막에 양도, 특정 kDNA 프로브에 hybridized되었다. 긍정적인 신호를 보여주는 샘플 통합 지점을 결정하는 복제에 사용되었다. kDNA의 조합과 Gg1에 Gg6의 타겟은 젤 위에 표시됩니다. 연속적인 PCR 반응은 kDNA minicircles (파란색)과 조류 순서 (녹색)와 대상 kDNA - 호스트의 DNA 시퀀스를 증폭. (열대 질환에게 3 소외감 PLoS에서 재판).
그림 2. 유전자 mitochondrial kDNA의 통합에 의해 수정된 9 개월 된 닭고기의 장애 심장 기능의 임상 발현은 T.에서 minicircle cruzi. 컨트롤 9 개월 된 chicke의 밝은 붉은 빗과 자주색 빗의 대조를 보여주는 mitochondrial kDNA 변이된 닭고기 가난한 혈액 산소N 심장 손상으로부터 무료입니다. (열대 질환에게 3 소외감 PLoS에서 수정됨).
그림 3. kDNA 변이와 Gallus gallus의 병리 그로스와 미세한. ) Cardiomegaly 심장 마비로 사망 9 개월 된 암탉 인치 noninfected 9 개월 된 암탉으로부터 B)를 제어 마음. C) 세포 독성 lymphocytes하여 대상 심장 세포의 거절이 : 면역 lymphocytes하여 대상 세포 lyses있는 최소한의 거부 단위는 (동그라미)이 그려져 있습니다. D) 제어 마음 조직학 (열대 질병에게 3 소외감 PLoS에서 수정됨).
그림 4. 그림 3에 표시된 kDNA-변이된 닭고기의 마음을 침투 면역 체계 세포의 Immunocytochemical 분석합니다. ) CD45 + lymphocytes 마음 르로 (화살표) 식별phycoerythrin-라벨이 특정 단클론 항체에 의한 sions. B) CD8 + 마음의 심각한 파괴에 관여 γδ 면역 lymphocytes (화살표). C) 풍부한 CD8α + T 세포는 심장 세포 lyses과 심각한 병변에 존재. 삽입은 제어 감염되지 않은 닭 가슴 (열대 질병에게 3 소외감 PLoS에서 수정됨)에서 면역 체계 세포의 부재를 보여줍니다.
그림 5. dystrophin 유전자의 kDNA 통합과 F2 자손의 확장성 심근증 염증성 Chagas 같은. 흉강 (심장 중량 = 16 G)의 대부분을 차지하는 10 개월 된 닭고기의) 열려진 마음. B) 다크 원형 mononuclear 세포의 infiltrates 및 kDNA-변이된 암탉의 myocardium을 파괴합니다. 10 개월 된 제어 닭고기 C) 정상 심장 크기 (무게 7g). 제어 닭 심장 D) 일반 조직학. (PLoS에서 수정된 소외감 트로픽알 질환 3).
그림 6. kDNA - 변이된 닭고기와 인간 Chagas 질병의 비교 병리학. kDNA-변이된 닭고기의) 심한 심근염 및 대상 심장 세포 lyses. Chagas 심장 질환의 경우에 면역 lymphocytes에 의한 B) 심한 심근염 및 대상 세포 lyses. kDNA-변이된 닭고기의 면역 lymphocytes에 의해 심장 세포 C) 거부. 인간 Chagas 질병의 면역 lymphocytes에 의해 심장 세포 D) 거절. Hematoxilin과 Eosin으로 스테인드. (Memórias에서 수정 할 Instituto 오스왈드 크루즈, 리오데 자네이로 14).
Discussion
평생 T.에 감염될 포유류와는 달리 cruzi 감염은 닭은 찰리의 내화물입니다 cruzi 감염. 치킨 모델 시스템의 주요 이점은 배아 면역 시스템의 개발에 초기 감염의 제거이다. 따라서 닭 몸 안에 남아있는 유일한 기생충의 DNA가 여러 loci에 통합되어 있습니다.
악성 T.의 최적 수량의 사용 cruzi이 풍부한 달걀을 예방하기 위해 trypomastigotes 것은 닭 배아의 게놈에 kDNA minicircles의 통합을 획득 향한 중요한 단계입니다. 100 trypomastigotes과 주사 계란의 실시간 병아리 부화의 비율은 500 기생충으로 얻은 그보다 4 배 높다. 케어는 계란 공기 챔버에 배지 10 μL에 기생충 서스펜션을 예방하기 위해 이동해야합니다. 흰자위에 대한 누설이 없어야합니다. 최적의 조건에서 세포내 기생 감염 장소 위스콘신 소요이후 감염이 타고난 면역에 의해 제거되며 몇 시간 일주일 동안 호스트 세포 진행 내부 부화 및 기생충 곱셈 후 얇게. kDNA 통합 사는 감염이되어 있어야하고, 초기 배아 닭 계란에 알몸 minicircles의 접종은 통합을 초래하지 않습니다. kDNA-양성 배아와 컨트롤은 37.5 ° C와 65 %의 습도에서 통제된 조건에서 지내게됩니다. 새끼는 33 ° C의 실온에서 두 주 동안 새장에 보관됩니다. 이후 닭고기가 22 방에 1.5 미터 너비 통로를 지나서으로 구분 정지 랙에 케이지에 보관 ° C에서 여과 공기와 동물 복지 조건을 확보하기 위해 지속적인 피로 미만의 긍정적인 압력. 성인 치킨 수유를 먹인 연령 다섯 개월 달걀을 세우고, 전체 성장과 성숙을 달성하기 위해 음료수 실행 물을 마실 수 있습니다. T. 작업시 위생 절차의 유지 보수 결과의 재현성을 위해 필수입니다 cruzi가 주사비옥한 닭고기 계란에.
치킨 모델 시스템 T.에서 cruzi 감염은 태아 성장의 초기 시대의 면역 체계의 발달 이후 일으킬 수있는 요소들은 미리 제거된다. 또한이 T.부터 부화 새끼 감염없이되는 방법 cruzi는 기생충의 항원에 대한 관용이며, 특정 항체의 부족으로, 계란을 주사. 세포 독성 lymphocytes (최소 거부 유닛, 그림 3)에 의해 대상 심장 세포의 거부 반응은 면역 감시 3 유전자형 수정 및 고장을 보여주 kDNA-변이된 닭을 볼 수 있습니다. genotypically 수정된 T-세포는 신체에서 자기 조직의 가속 거절을 제시. 주요 병변 사이트 Chagas 질병의 특징은 마음입니다. physiopathologic 상태 (감시) physiologic의 통로가 clonally 세포 독성 lymphocytes 3의 확산을 보여주는 kDNA-변이된 닭고기에서 볼 수있다.
티그의 transkingdom 모델 시스템은 T.으로 게놈 수정에서 형태소 분석, 기생충 유발, 유전자 중심의 자기 면역 질환 (그림 6)을 보여줍니다 cruzi kDNA는 통합을 minicircle. 이러한 수정은 LB-주사 계란에서 부화 새끼로 볼 수 없습니다.
이러한 현상은 자기 조직의 거절을 방지하기 위해 약물 myocardium에 침투해 특정 T 세포의 표현형의 골수 시조의 억제, 그리고 histocompatible 건강한 골수의 이식이 필요할 수 있습니다 kDNA-변이된 병아리의 염증성 면역 심근증의 실험적 치료를 제안합니다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 낸시 R. Sturm, 면역학학과 미생물학과 분자 생물학, 비판적 독해 원고에 대한 의학의 데이비드 Geffen 학교, 로스 앤젤레스 캘리포니아 대학에게 빚을 졌네. 연구 CNPq 국립위원회, 연구 개발 - FAPDF, 브라질 재단은 연구를 지원. 우리는 브라질리아, 브라질 대학에서, 알레산드로 O. 수자, 마리아 C. Guimaro, Ciro Cordeiro, 아나 드 계수나무 로사, Roseneide의 알베스, 그리고 라파엘 엔드레데의 기술적 지원을 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Taq DNA Polymerase Recombinant | Invitrogen | 11615-010 | |
| Platinum Taq DNA Polymerase | Invitrogen | 10966-030 | |
| Random Primers DNA Labeling System | Invitrogen | 18187-013 | |
| EcoRI | Invitrogen | 15202-021 | |
| MboI | Invitrogen | 15248-016 | |
| dNTP Set, 100mM Solutions | GE Healthcare | 28-4065-51 | |
| Amersham Hybond - N+ -- Cat n. | GE Healthcare | RPN303B | |
| PlasmidPrep Mini Spin kit | GE Healthcare | 28-9042-70 | |
| NsiI | Sigma-Aldrich | R5884 1KU | |
| DNA, Sodium Salt Fish Sperm | AMRESCO | 0644-10G | |
| Mouse anti-chicken Bu-1b | SouthernBiotech | 8370-02 | |
| Mouse anti-chicken CD45 | SouthernBiotech | 8270-08 | |
| Mouse anti-chicken TCRγδ | SouthernBiotech | 8230-08 | |
| Mouse anti-chicken CD8α | SouthernBiotech | 9220-02 | |
| Mouse anti-chicken monocyte/macrophage | SouthernBiotech | 8420-02 | |
| MyCycle Termocycler | Bio-Rad | 580BR 5501 |
References
- Teixeira, A. R. Pathogenesis of chagas' disease: parasite persistence and autoimmunity. CMR. 24, 592-630 (2011).
- Teixeira, A. R. Chagas disease. Postg. Med. J. 82, 788-798 (2006).
- Teixeira, A. R. Trypanosoma cruzi in the chicken model: Chagas-like heart disease in the absence of parasitism. PLoS Negl. Trop. Dis. 5, e1000 (2011).
- Hecht, M. M. Inheritance of DNA transferred from American trypanosomes to human hosts. PLoS One. 5, e9181 (2010).
- Xing, Z. Roles of the ERK MAPK in the regulation of proinflammatory and apoptotic responses in chicken macrophages infected with H9N2 avian influenza virus. J. Gen. Virol. 91, 343-351 (2010).
- Kim, H. B. NIK and IKKbeta interdependence in NF-kappaB signalling--flux analysis of regulation through metabolites. Biosystems. 99, 140-149 (2010).
- Karakhanova, S. ERK/p38 MAP-kinases and PI3K are involved in the differential regulation of B7-H1 expression in DC subsets. Eur. J. Immunol. 40, 254-266 (2010).
- Finsterer, J. The heart in human dystrophinopathies. Cardiology. 99, 1-19 (2003).
- Nitz, N. Heritable integration of kDNA minicircle sequences from Trypanosoma cruzi into the avian genome: insights into human Chagas disease. Cell. 118, 175-186 (2004).
- Simpson, L. Kinetoplast DNA in trypanosomid flagellates. Int. Rev. Cytol. 99, 1-19 (1986).
- Bonney, K. M. Heat-killed Trypanosoma cruzi induces acute cardiac damage and polyantigenic autoimmunity. PLoS One. 6, e14571 (2011).
- Moser, D. R. Detection of Trypanosoma cruzi by DNA amplification using the polymerase chain reaction. J. Clin. Microbiol. 27, 1477-1482 (1989).
- Sturm, N. R. Sensitive detection and schizodeme classification of Trypanosoma cruzi cells by amplification of kinetoplast minicircle DNA sequences: use in diagnosis of Chagas' disease. Mol. Biochem. Parasitol. 33, 205-214 (1989).
- Teixeira, A. R. Evolution and pathology in chagas disease--a review. Mem. Inst. Oswaldo Cruz. 101, 463-491 (2006).
- Yurchenko, V. Y. Structure of Leishmania minicircle kinetoplast DNA classes. J. Clin. Microbiol. 37, 1656-1657 (1999).
- Simpson, L. The genomic organization of guide RNA genes in kinetoplastid protozoa: several conundrums and their solutions. Mol. Biochem. Parasitol. 86, 133-141 (1997).
- Thomas, S. A non-universal transcription factor? The Leishmania tarentolae TATA box-binding protein LtTBP associates with a subset of promoters. Int J. Parasitol. 36, 1217-1226 (2006).
