La dissection de souris adultes et utricule adénovirus-support cellulaire des infections

Résumé

Cellules ciliées mécanosensorielle sont les cellules réceptrices de l'oreille interne. Le mieux caractérisé In vitro de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d'organes de utricules de souris adultes. Nous présentons la dissection de l'utricule souris adulte, et nous démontrons adénovirus infection de cellules de soutien dans les utricules culture.

Résumé

La perte d'audition et de troubles de l'équilibre sont souvent causés par la mort des cellules ciliées mécano, qui sont les cellules réceptrices de l'oreille interne. Comme il n'y a pas de ligne de la cellule qui représente de façon satisfaisante les cellules ciliées de mammifères, de la recherche sur les cellules ciliées se fonde sur les cultures d'organes primaires. Le mieux caractérisé dans le système modèle in vitro de cellules matures des poils des mammifères utilise des cultures d'organes de utricules de souris adultes (Figure 1) ^1-6. L'utricule est un organe vestibulaire, et les cellules ciliées de l'utricule sont semblables dans les deux à la structure et la fonction des cellules ciliées de l'organe auditif, l'organe de Corti. La préparation utricule souris adultes représente un épithélium sensoriel maturité pour les études des signaux moléculaires qui régulent la survie, l'homéostasie, et la mort de ces cellules.

Mammifères cellules ciliées cochléaires sont définitivement différenciés et ne sont pas régénérés quand ils sont perdus. En non-mamvertébrés maliens, auditif ou vestibulaire de la mort des cellules ciliées est suivie d'une régénération robuste qui rétablit les fonctions auditives et l'équilibre ^{7, 8.} La régénération des cellules de cheveux est médiée par la glie-comme les cellules de soutien, qui sont en contact les surfaces basolatérale des cellules ciliées de l'épithélium sensoriel ^{9, 10.} Cellules de soutien sont aussi des médiateurs importants de la survie des cellules ciliées et de la mort ^11. Nous avons récemment développé une technique pour l'infection des cellules de soutien dans les utricules cultivées en utilisant des adénovirus. Utilisation adénovirus de type 5 (dE1/E3) pour fournir un transgène contenant la GFP sous le contrôle du promoteur CMV, nous constatons que l'adénovirus spécifiquement et efficacement infecte les cellules de soutien. Soutenir l'efficacité infection de la cellule est d'environ 25-50%, et les cellules ciliées ne sont pas infectés (Figure 2). Surtout, nous constatons que l'infection adénovirale de cellules de soutien n'entraîne pas de toxicité pour les cellules ciliées ou des cellules de soutien, comme nombre de cellules dans Ad-GFP infutricules ecté sont équivalentes à celles en situation de non-infectés utricules (Figure 3). Ainsi l'expression des gènes adénovirus dans des cellules de soutien de utricules culture fournit un outil puissant pour étudier les rôles des cellules de soutien en tant que médiateurs de la survie des cellules des cheveux, la mort et la régénération.

Protocole

1. Dissection utricule et de la Culture

1. Euthanasier un adulte (âge de 4 semaines ou plus) de la souris en utilisant un protocole approuvé et décapiter.
2. Snip le conduit auditif externe sur les deux côtés de la tête et tirer la peau vers l'avant en direction du nez. Bissecter la tête d'arrière en avant et retirez le cerveau des deux côtés de révéler le labyrinthe osseux.
3. Coupez le crâne loin de la cochlée osseuse et à transférer le labyrinthe osseux (y compris la bulle) pour une hotte de culture de tissus équipé d'un microscope à dissection (Remarque: le travail adénovirus doit être effectuée dans un cabinet de classe II de la....

Discussion

Cellules ciliées sensorielles sont sensibles à la mort causée par une variété de stress, notamment le vieillissement, traumatisme sonore, et l'exposition à des médicaments ototoxiques, y compris les antibiotiques aminoglycosides et le cisplatine agent antinéoplasique. Dans les résultats mammifères cheveux de la mort cellulaire dans la perte d'audition permanente et / ou perturbation de l'équilibre. Dans les systèmes de modèle in vitro sont des outils essentiels pour les études visant à déte.......

Matériaux

199

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactif Société
Gibco / Invitrogen	12350
DMEM/F12	Gibco / Invitrogen	11320
Beaux-pince (# 55)	Outils belle science	11255-20
Beaux-pince (# 5)	Outils belle science	11252-30
Pince (# 3)	Outils belle science	11231-30
La pénicilline G	Sigma	P3032
Le sérum fœtal bovin	Invitrogen	10082-139
Nunc mini-bac	Fisher	12-565-68
Adénovirus-GFP	Vecteur Biolabs	1060 *
Cal-Ex détartrant	Fisher	CS510-1D
Sigma	452882
Anti-myosine 7a (polyclonal)	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-myosine 7a (monoclonal)	Études de développement de la Banque d'hybridome	MYO7A 138-1
Anti-calmoduline	Sigma	C 3545
Anti-calbindin	Chemicon	AB1778
Fluoromount G	Southern Biotechnology Associates	0100-01

Tableau 1. Réactifs et les outils utilisés dans la culture utricule et infection par un adénovirus.

* Remarque: Ad-GFP est normalement fournie par Biolabs Vecteur à un titre de stock de 1x10 ¹⁰ PFU / ml. Nous avons demandé une amplification personnalisée afin de fournir le stock de virus à un titre de 1,2 × 10 ¹¹ PFU / ml.