Dissezione di utricolo topo adulto e adenovirus-mediata non protagonista infezione delle cellule

Summary

Cellule ciliate Mechanosensory sono le cellule recettori dell'orecchio interno. Il più caratterizzato

Abstract

La perdita dell'udito e disturbi dell'equilibrio sono spesso causati dalla morte delle cellule ciliate mechanosensory, che sono le cellule recettori dell'orecchio interno. Poiché non vi è alcuna linea cellulare che rappresenta in modo soddisfacente le cellule ciliate dei mammiferi, la ricerca sulle cellule dei capelli si basa su colture primarie di organi. Il più caratterizzato modello in vitro di cellule mature per capelli mammifero utilizza colture organo di otricoli da topi adulti (figura 1) ^1-6. L'utricolo è un organo vestibolare, e le cellule ciliate del utricolo sono simili nella struttura e funzione delle cellule ciliate dell'organo uditivo, l'organo del Corti. Il mouse gli adulti, utricolo rappresenta un epitelio sensoriale matura per lo studio dei segnali molecolari che regolano la sopravvivenza, l'omeostasi, e la morte di queste cellule.

Mammiferi cellule ciliate cocleari sono terminalmente differenziate e non vengono rigenerati quando vengono persi. In non-mamvertebrati del Mali, uditivi o vestibolare morte delle cellule dei capelli è seguita dalla rigenerazione robusto che ripristina le funzioni dell'udito e dell'equilibrio ^{7, 8.} Rigenerazione delle cellule dei capelli è mediata da cellule gliali, come le cellule di supporto, che contattano le superfici basolaterale delle cellule ciliate nell'epitelio sensoriale ^{9, 10.} Cellule di sostegno sono anche importanti mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli e la morte ^11. Abbiamo recentemente sviluppato una tecnica per infezione di cellule di sostegno in otricoli coltura con adenovirus. Utilizzo di adenovirus di tipo 5 (dE1/E3) per fornire un transgene contenente GFP sotto il controllo del promotore CMV, troviamo che adenovirus specificamente e infetta efficacemente le cellule di supporto. Sostenere infezione efficienza della cella è di circa 25-50%, e le cellule dei capelli non sono infettati (figura 2). Importante, troviamo che l'infezione adenovirale di cellule di sostegno non comporta la tossicità per le cellule ciliate o cellule di supporto, come il conteggio delle cellule in Ad-GFP infette otricoli sono equivalenti a quelle non infette otricoli (Figura 3). Così adenovirus-mediata espressione genica in cellule di sostegno di otricoli coltivate fornisce un potente strumento per studiare i ruoli di cellule di sostegno come mediatori di sopravvivenza delle cellule dei capelli, la morte e rigenerazione.

Protocol

1. Otricolo Dissection e Cultura

1. Eutanasia di un adulto (4 settimane di età) del mouse utilizzando un protocollo approvato e decapitare.
2. Snip il canale uditivo esterno su entrambi i lati della testa e tirare la pelle in avanti verso il naso. Dividono in due la testa da dietro in avanti e rimuovere il cervello da entrambi i lati per rivelare il labirinto osseo.
3. Tagliare il cranio dalla coclea ossea e trasferire il labirinto osseo (compresa la bolla) ad una cappa coltura tissutale dotato di un microscopio per dissezione (Nota: lavoro Adenovirus deve essere eseguita in una cappa di sicurezza biologica di classe II).
4. Nel cappuccio, trasferire ciascuna coclea di un piatto 35 millimetri coltura tissutale sterili contenenti supporti dissezione (M199, Gibco / Invitrogen # 12.350) (Figura 1A).
5. Se la bulla uditivo è ancora intatto (è possibile rimuovere il bulla durante la dissezione lordo inserendo il pollice tra la bulla e l'apice dila coclea), utilizzare due pinze (uno # 3 e uno # 5) per rompere la bulla (Figura 1B).
6. Identificare i punti di riferimento della preparazione ossea coclea: ossicini apice, base,, ovali e tonde finestre, radice del nervo VIII, canali semicircolari (Figura 1 C, D).
7. Posizionare l'orecchio interno nel piatto con il lato mediale rivolto verso l'alto, in modo tale che l'ovale e rotonda finestre e all'apice sono sul fondo del piatto e la radice del nervo VIII è rivolto verso l'alto. Tenere il preparato utilizzando un # 3 pinza nella regione dei canali semicircolari (Figura 1D).
8. Usando un bisturi dotato di una lama # 11, tagliare l'apice della coclea appena apicale della radice del nervo (Figura 1D).
9. Ruotare il preparato in modo che la porzione di taglio è rivolto verso l'alto. Utilizzare il canale anteriore semicircolare come maniglia per stabilizzare la preparazione (Figura 1E).
10. Utilizzando # 5 pinzette, rimuovere la coclea alle modiolus verso il bassoalla base. Nel punto in cui la regione gancio della coclea gira verso il basso, utilizzare una sonda sottile (mezzo di una pinza rotti # 55) per sollevare l'ultimo ripiano ossea della lamina spirale ossea (figura 1F), rivelando la sacculo. Appena sotto il sacculo è la pedana della staffa, che è un importante punto di riferimento. Il otricolo è immediatamente adiacente alla pedana staffa (figura 1G), ed è circondato da osso. Utilizzare la sonda a scheggiare l'osso distanza sufficiente per rivelare circa 1/3 del otricolo. Rimuovere con attenzione il otricolo utilizzando N ° 55 pinze (Figura 1 H). Questa procedura di solito provoca la rimozione del tetto dell'epitelio pigmentato come utricolo è tirato dalla preparazione ossea. Tuttavia, se il otricolo viene rimosso con l'epitelio intatto tetto, il tetto può essere rimosso utilizzando # 55 pinze.
11. Otricoli per l'infezione da adenovirus (o esperimenti di imaging dal vivo) deve avere il otoconia rimossa durante la dissezione (prima infezione).In questo caso, utilizzare una siringa luer-lock che viene riempito con mezzi di dissezione e dotata di un piccolo foro dell'ago (di solito 26-28 gauge). Tenere il otricolo sul bordo utilizzando N ° 55 pinze (Figura 1I). Portare la punta dell'ago vicino al otricolo con la smussatura dell'ago verso il basso. Utilizzare un flusso di dissezione media per soffiare via la otoconia (Figura 1J). In alternativa, otoconia possono essere rimosse mediante spazzolatura loro fuori utilizzando uno strumento di ciglia (Ted Pella, Inc. # 113). Otricoli che non vanno a subire l'infezione adenovirale sono normalmente coltivate liberamente fluttuante in piastre di tessuto a 24 pozzetti con l'intatta otoconia (vedi sotto per la rimozione post-fix otoconia, che è più facile).
12. Una volta che tutti otricoli sono sezionati, cambiare i media sezionare alla cultura dei media sterile: DMEM F12 (Gibco # 11320) supplementato con 5% di FBS e 50 U / ml di penicillina G (Sigma).
13. Otricoli vengono coltivate a 37 ° C e 5% CO _2. Se le culture devono essere maintaINED per più di 48 ore, la metà dei terreni di coltura dovrebbero essere cambiati ogni altro giorno. Le culture possono essere mantenuti per una settimana o più.

2. L'infezione Adenovirus di cellule di supporto

Importante: Lavorare con adenovirus richiede livello di biosicurezza 2 (BSL2) procedure e certificazione. Verificare con il responsabile istituzionale biosicurezza di orientamento e formazione sulle procedure di BSL2.

1. Dissect otricoli come sopra in media di dissezione (no siero). Rimuovere otoconia come sopra.
2. Quando si è pronti per infettare, trasferire 1 utricolo (cellule ciliate up) in ciascun pozzetto di una Nunc mini-vassoio (Fisher # 12-565-68) con 15 microlitri di siero-free DMEM F12 (questo è importante perché siero può inattivare il virus) . Questo trasferimento è più facile con uno 1,5 mm microcurette (# 10082-15 da Strumenti Scienza Arti).
3. Il nostro Ad-GFP è sierotipo 5 con i geni virali E1 ed E3 eliminati e il promotore umano CMV guida del transgene (GFP). Questo virus è stato ottenuto da vettore BioLabs (Philadelphia, PA vectorbiolabs.com ). Virus archivio sono forniti a titoli di 1,0-4,0 × ¹⁰ 10 PFU / ml. Aggiungere 0,5-2 microlitri di virus disponibile in ciascun pozzetto contenente un utricolo (Figura 1L). L'importo effettivo utilizzato varia a seconda del titolo virale e il brodo. Noi di solito infettano ogni otricolo con 1,0-4,0 × 10 ⁷ PFU.
4. Cultura le otricoli in virus contenenti supporti a 37 ° C / 5% CO ₂ per 2 ore. Dopo 2 ore, trasferire i otricoli Torna alla piastra da 24 pozzetti di coltura contenente terreno di coltura con il siero. Culture i otricoli notte a 37 ° C / 5% CO _2.
5. Otricoli può essere utilizzato il giorno successivo per gli esperimenti di imaging dal vivo, oppure possono essere fissati per immunochimica capelli cella (vedi sotto). Virali transgenici aumenta di espressione nel corso del tempo, quindi se l'espressione del transgene è bassa a 24 ore dopo l'infezione si puòvantaggioso cellule di coltura ulteriori 24 ore nel siero contenenti supporti. Se vedi la tossicità delle cellule dei capelli, ridurre la quantità di virus usato.

3. Fissazione utricolo, rimozione otoconia e immunochimica

1. Al termine del periodo di coltura, otricoli fissare in paraformaldeide al 4% sia per 3 ore a temperatura ambiente (su una piattaforma oscillante) o per una notte a 4 ° C. Otricoli lavaggio (3 volte, a 15 minuti cadauna) a 0,1 M (1X) pH Sorensen tampone fosfato 7,4. Questi passaggi sono eseguiti in una piastra da 24 pozzetti di coltura tissutale.
2. Rimozione otoconia: Nota: otoconia deve essere rimossa prima dell'infezione adenovirus (vedere il passaggio sopra 1,11). Tuttavia, otricoli che non devono essere infetti possono essere coltivate e fissato con la otoconia ancora intatta. In questo caso, utilizzare i passaggi descritti qui per rimuovere il otoconia dopo la fissazione. Controllare otricoli per qualsiasi epitelio pigmentato rimanenti tetto. Rimuovere con cautela qualsiasi residuo epitelio tetto con due f # 55orceps. Per rimuovere il otoconia, sostituire tampone fosfato Sorensen con 750-1000 microlitri Cal-Ex decalcificatore (Fisher # CS510-1D). Lascia Cal-Ex su otricoli per 1 minuto e 40 secondi (non superare i 2 minuti). Sostituire Cal-Ex con 0,1 M tampone fosfato di Sorensen e di lavaggio (5 volte, 5 minuti ciascuno).
3. Incubare otricoli di boroidruro di sodio (Sigma # 452882, 1% in acqua deionizzata) per 10 minuti. Lavare otricoli in 0.1 M tampone fosfato di Sorensen (5 volte, 5 minuti ciascuno).
4. Otricoli di luogo in Blocking Solution (PBS + 2% albumina di siero bovino + 0,8% siero di capra normale + 0,4% Triton X-100) per 3 ore a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.
5. Aggiungere anticorpi primari e incubare durante la notte a 4 ° C. Anti-miosina 7a (o Proteus Biosciences # o # 25-6790 MYO7A 138-1 dal Developmental Studies Ibridoma Bank) a 1:100 nel bloccare le etichette soluzione tutte le cellule dei capelli. Per etichettare separatamente le cellule ciliate striolar e non striolar, abbiamo usato un doppio-label protocol con un anticorpo monoclonale anti-calmodulina (Sigma C # 3545, 1:150) e policlonali anti-calbindin (Chemicon # AB1778, Temecula, CA, USA; 1:200). Anticorpi secondari (di solito Alexa Fluor anticorpi coniugati secondari di Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) sono diluiti 1:500 in soluzione bloccante e incubate per 4 ore al buio a temperatura ambiente su una piattaforma oscillante.
6. Otricoli Mount su vetrini utilizzando Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, USA).

4. Risultati rappresentativi

Otricoli coltivate utilizzando questo metodo mantenere pieno complemento di entrambe le cellule dei capelli e le cellule di supporto (Figura 2). Cellule ciliate nelle culture sani mostrano profili tondi nucleari circondate da sottili regioni citoplasmatici che sono miosina 7a-positivo (Figura 2, pannello superiore). Cellule di sostegno (con etichetta anti-Sox2) sono più piccoli e più densamente di cellule ciliate (Figura 2, pannello inferiore). Adenovirus infetta il 25-50% delle cellule di supporto nella utricolo, e non sono infettate cellule ciliate (Figura 2, Ad-GFP pannelli). Va osservato che il titolo di lavoro ottimale di ciascun adenovirus deve essere determinato empiricamente, poiché la morte delle cellule capelli è possibile se il titolo virale è troppo elevato. Inoltre, le regioni di danni meccanici (causati durante la dissezione) avrà grandi quantità di virus. Queste regioni di danneggiamento meccanico sono facilmente distinguibili da una linea continua di cellule con livelli molto elevati di espressione di GFP e cellule cigliate mancanti. Questo è in contrasto con l'espressione GFP dispersa in cellule di sostegno di una coltura non danneggiato (Figura 2).

Figura 1. Otricolo Dissection. A:. Auditory bulla (AB) B:. La bolla è rotto con due pinze robuste C: Bony coclea (RW = finestra rotonda, S =. arteria stapediale, C = coclea, ST = staffa) D: Una lama di bisturi (SB) viene utilizzato per tagliare l'apice della coclea apicale al nervo craniale VIII (8 ^° N) ASC = canale semicircolare anteriore E..: La preparazione viene tenuto fermamente con un # 3 pinza con una forchetta inserito nel canale anteriore semicircolare (ASC) e l'altra sull'osso esterno (frecce). Il labirinto membranoso viene rimossa con pinze F:. Con il labirinto membranoso rimosso, il giro basale della lamina spirale ossea è visibile vicino alla regione gancio. Una sonda sottile viene inserita sotto questa piattaforma ossea per sollevare la piattaforma e rimuoverlo (freccia) G:. Dopo la rimozione del sacculo, utricolo (U) è visibile immediatamente adiacente alla pedana della staffa (SF) H:. Utricolo (U ) viene rimosso utilizzando un pinza # 55 (freccia) SF = pedana staffa I:.. otricolo con otoconia (O) parzialmente rimosso und sensoriali epitelio (SE) sotto visibili J:. otoconia (O) vengono rimossi dal otricolo utilizzando un flusso di supporto fornito da una siringa munita di un 26-gauge. L'ombra dell'ago (S) è visibile nella parte inferiore dell'immagine K:. Otricolo con otoconia rimosso e epitelio sensoriale (SE) visibile L:. Infezione adenovirale: ogni otricolo (U) è collocato in un singolo pozzetto di una mini -tray. Cellule di supporto sono infettate con adenovirus pipettando virus nel pozzo (P = punta della pipetta).

Figura 2. Adenovirus-mediata infezione di cellule di sostegno. Otricoli sono state infettate con espressione di adenovirus di guida di proteina fluorescente verde (Ad-GFP). Vengono mostrati immagini confocali dello strato di cellule capelli e lo strato di cellule di supporto nella stessa area di un dell'utricolo. Cellule ciliate sono etichettate con un anticorpo contro 7a miosina(Magenta). Cellule di sostegno sono etichettate con un anticorpo contro Sox2 (rosso). Mostra la struttura schematica dell'epitelio otricolo sensoriale e le posizioni delle cellule capellute (HC) e cellule di supporto (SC). Posizioni di confocali (ottica) sezioni mostrate in alto (U) e inferiore (L) pannelli sono indicati da linee tratteggiate nella schematica. I pannelli superiori: Nelle immagini confocali adottate a livello dei nuclei delle cellule dei capelli, Ad-GFP segnale appare negli spazi tra le cellule dei capelli e non si sovrappone con la 7a capelli miosina marker delle cellule. Pannelli inferiori: In sezioni confocali a livello dei nuclei di supporto, Ad-GFP segnale colocalizza con il marcatore della cella di supporto Sox-2. Ad-GFP risultati infezione nell'espressione GFP in cellule di sostegno solo, e non cellule ciliate sono infetti.

Figura 3. Infezione adenovirale non provocare la morte delle cellule ciliate o cellule di supporto. Utricles sono stati infettati con Ad-GFP a 4 × 10 ⁸ PFU / ml. Otricoli sono state marcate con anticorpi anti-miosina 7 (marker delle cellule dei capelli) e Sox2 (marker delle cellule di sostegno). Cellule dei capelli e della conta delle cellule di supporto sono stati pari a otricoli di controllo e Ad-GFP otricoli infetti.

Discussion

Cellule sensoriali sono suscettibili di morte causata da una varietà di stress, compreso l'invecchiamento, trauma rumore, e l'esposizione a farmaci ototossici, compresi gli aminoglicosidi e l'agente antineoplastico cisplatino. Nei risultati di cellule di mammiferi di morte per capelli in perdita permanente dell'udito e / o disturbi dell'equilibrio. In sistemi modello in vitro sono strumenti fondamentali per gli studi volti a determinare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della morte delle cellule dei capelli, nonché quelle volte a prevenire o invertire la morte delle cellule dei capelli . A differenza di cellule ciliate cocleari di mammiferi adulti, le cellule dei capelli della otricolo sopravvivono bene in coltura. Cellule ciliate utricolo sono sensibili alla morte dall'esposizione agli stessi farmaci terapeutici che sono tossici per le cellule ciliate cocleari e dei meccanismi cellulari alla base ototossici la morte delle cellule dei capelli e la sopravvivenza sono simili per le cellule ciliate cocleari sia utricular e ^12-18. Inoltre, quando i dati ottenuti nel sistema modello otricolo sono TEsted in vivo, la preparazione utricolo ha dimostrato di essere un fattore predittivo affidabile di sopravvivenza delle cellule dei capelli e la morte nel maturo coclea ^{12, 18-21.} La preparazione otricolo del mouse ci permette anche di esaminare gli effetti delle proteine ​​specifiche utilizzando otricoli da animali transgenici e knockout.

I segnali che mediano la sopravvivenza e la morte delle cellule ciliate sensorie sotto stress sono poco conosciuti. Tuttavia, l'evidenza che emerge suggerisce che altri tipi di cellule dell'orecchio interno possono giocare un ruolo importante nel determinare se le cellule ciliate in condizioni di stress in definitiva, vivere o morire ^{11, 22, 23.} Il sistema modello otricolo può essere usato per esaminare queste critiche interazioni cellula-cellula in un mammifero maturo epitelio sensoriale. Infezione adenovirale fornisce un metodo per alterare l'espressione genica in cellule di supporto, facilitando così studi sul ruolo (s) di cellule di sostegno nella sopravvivenza cellulare capelli, morte, fagocitosi, e rigenerazione.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medium 199	GIBCO, by Life Technologies	12350
DMEM/F12	GIBCO, by Life Technologies	11320
Fine forceps (#55)	Fine Science Tools	11255-20
Fine forceps (#5)	Fine Science Tools	11252-30
Forceps (#3)	Fine Science Tools	11231-30
Penicillin G	Sigma-Aldrich	P3032
Fetal bovine serum	Invitrogen	10082-139
Nunc mini-tray	Fisher Scientific	12-565-68
Adenovirus-GFP	Vector Biolabs	1060*
Cal-Ex decalcifier	Fisher Scientific	CS510-1D
sodium borohydride	Sigma-Aldrich	452882
Anti-Myosin 7a (polyclonal)	Proteus Biosciences	25-6790
Anti-Myosin 7a (monoclonal)	Developmental Studies Hybridoma Bank	MYO7A 138-1
Anti-Calmodulin	Sigma-Aldrich	C 3545
Anti-Calbindin	Chemicon International	AB1778
Fluoromount G	SouthernBiotech	0100-01
Table 1. Reagents and tools used in utricle culture and adenovirus infection
* Note: Ad-GFP is normally provided by Vector Biolabs at a stock titer of 1x1010 PFU/ml. We requested a custom amplification in order to provide the stock virus at a titer of 1.2×1011 PFU/ml.