機械刺激有毛細胞は、内耳の受容細胞である。最高の特徴 in vitroでモデルシステムでは、成体マウスからutriclesの器官培養を利用しています。我々は、成体マウスの卵形嚢の解剖を提示し、我々は培養utriclesで支持細胞のアデノウイルス媒介性感染症を示しています。
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サマリー
要約
聴力損失とのバランス障害は、しばしば内耳の受容細胞である機械刺激有毛細胞の死によって引き起こされます。満足哺乳類の有毛細胞を表すには細胞株が存在しないため、有毛細胞の研究は主要な器官培養に依存しています。成体マウス（ 図1）1-6からutriclesの器官培養を利用して成熟した哺乳類の有毛細胞の in vitroモデル系では最高を特徴とする。卵形嚢、前庭器官であり、卵形嚢の有毛細胞は、聴覚器官、コルチ器官の有毛細胞の構造と機能の両方に似ています。成体マウスの卵形嚢の準備は、生存、恒常性、およびこれらの細胞死を制御する分子シグナルの研究のための成熟した感覚上皮を表しています。
哺乳類の蝸牛有毛細胞は、分化され、それらが失われた場合、再生成されていません。非哺乳類の哺乳類、脊椎動物、聴覚または前庭有毛細胞の死は、聴覚やバランス機能7、8を復元する堅牢な再生が続いている。有毛細胞の再生は、感覚上皮9、10に有毛細胞の基底面を連絡グリア細胞のような支持細胞によって媒介される。支持細胞はまた、有毛細胞の生存および死亡11の重要なメディエーターである。我々は最近、アデノウイルスを用いて培養utricles内のセルをサポートしている感染の技術を開発した。 CMVプロモーターの制御下にGFPを含むトランスジーンを提供するためにアデノウイルス5型（dE1/E3）を使用して、我々は特にそのアデノウイルスを見つけ、効率的に支持細胞に感染します。支持細胞の感染効率は約25から50パーセントであり、有毛細胞は（ 図2）感染していない。重要なのは、我々は、Ad-GFP infファイル内のセル数としてサポートしている細胞のアデノウイルス感染は、有毛細胞または支持細胞への毒性にはなりません見つけるected utriclesは、非感染utricles（ 図3）と同等です。したがって、培養utriclesの支持細胞のアデノウイルス媒介遺伝子発現は、有毛細胞の生存、死亡、そして再生のメディエーターとして支持細胞の役割を研究する強力なツールを提供しています。
プロトコル
1。卵形嚢解剖と文化
- 承認されたプロトコルと首をはねるを用いた成体（4週齢以上）マウスを安楽死させる。
- 頭の両側に外耳道を切り取ると、鼻に向かって前方に肌を引き出します。後ろから前に頭を二分し、骨迷路を明らかにするために両側から脳を削除します。
- 離れて骨の蝸牛から頭蓋骨をトリミングして、解剖顕微鏡（注：アデノウイルス作業はクラスIIの生物学的安全キャビネット内で行うべきである）を装備した組織培養フードに骨迷路を（水疱を含む）を転送します。
- フードには、滅菌解剖メディアを含む35ミリメートル組織培養皿（M199、GIBCO / Invitrogen社＃12350）（ 図1A）にそれぞれ蝸牛を転送します。
- 聴覚水疱が無傷のままであれば（それが水疱との頂点の間にサムネイルを挿入することで総解剖中に水疱を除去することが可能です。蝸牛）、水疱（ 図1B）を破るために2つの鉗子（1＃3、1＃5）を使用します。
- 頂部、ベース、耳小骨、楕円形や円形の窓、VIIIth神経根、半規管（ 図1 C、D）：骨蝸牛の準備のランドマークを識別します。
- 楕円形と円形の窓と頂点が皿とVIIIth神経根の底にあることなどが上を向いて、上を向く内側に皿に内耳を配置します。半規管（ 図1D）の領域で第3位鉗子....
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ディスカッション
感覚毛細胞が老化、騒音外傷、およびアミノグリコシド系抗生物質と抗がん剤のシスプラチンを含む耳毒性薬物への暴露を含むさまざまなストレスによって引き起こされる死への影響を受けています。永久的な聴力損失および/ またはバランスの乱れの哺乳類の有毛細胞死の結果に表示されます。in vitroのモデル系では、細胞および分子メカニズムの根底にある有毛細胞の死と同様に、有毛細胞死を予防または逆転を狙ったものを決定することを目的と研究のための重要なツールです。 。大人の哺乳動物由来の蝸牛有毛細胞とは異なり、卵形嚢の有毛細胞は、培養にも生き残る。卵形嚢の有毛細胞は、蝸牛の有毛細胞に有毒である同一の治療薬への曝露から死に敏感であり、耳毒性有毛細胞死と生存の基礎となる細胞のメカニズムは、卵形嚢と蝸牛有毛細胞の12から18の両方に似ています。また、とき卵形嚢モデル系で得られたデータはTEです。in vivoでSTED、卵形嚢の準備が成熟した蝸牛12、18から21の有毛細胞の生存と死の信頼できる予測因子であることが証明されています。マウスの卵形嚢の製剤はまた、私.......
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開示事項
利害の衝突が宣言されません。
謝辞
この作品は、難聴やその他のコミュニケーション障害の国立研究所の学内研究部門によってサポートされていました。追加のサポートがNIDCD 5R01 DC007613によって提供されました。
....アクセスが制限されています。このコンテンツを表示するにはログインするか、トライアルを開始してください。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| 試薬会社概要カタログ番号 | |||
| 培地199 | GIBCO / Invitrogen社 | 12350 | |
| DMEM/F12 | GIBCO / Invitrogen社 | 11320 | |
| ファイン鉗子（＃55） | ファイン科学ツール | 11255から20 | |
| ファイン鉗子（＃5） | ファイン科学ツール | 11252から30 | |
| ピンセット（＃3） | ファイン科学ツール | 11231から30 | |
| ペニシリンG | シグマ | P3032 | |
| ウシ胎児血清 | インビトロジェン | 10082-139 | |
| ヌンクミニトレイ | フィッシャー | 12-565-68 | |
| アデノウイルス-GFP | ベクトル·バイオラブズ | 1060 * | |
| カル-EX decalcifier | フィッシャー | CS510-1D | |
| 水素化ホウ素ナトリウム | シグマ | 452882 | |
| アンチミオシン7aの（ポリクローナル） | プロテウスサイエンス | 25から6790 | |
| アンチミオシン7A（モノクローナル） | 発達研究ハイブリドーマバンク | MYO7A 138から1 | |
| アンチカルモジュリン | シグマ | C 3545 | |
| アンチカルビンジン | ケミコン | AB1778 | |
| Fluoromount G | サザンバイオテクノロジーアソシエイツ | 0100から01 |
表1。卵形嚢の文化やアデノウイルス感染症に使用される試薬およびツールを提供します。
*注：AD-GFPは、通常1×10の株式力価でベクトルBiolabs社によって提供されます 10 PFU / mlであった。我々は、1.2×10の力価に在庫のウイルスを提供するために、カスタムの増幅を要求された 11 PFU / mlであった。
参考文献
- Cunningham, L. L. The adult mouse utricle as an in vitro preparation for studies of ototoxic-drug-induced sensory hair cell death. Brain Res. , (2006).
- Schmitt, N. C., Rubel, E. W., Nathanson, N. M. Cisplatin-induced hair cell death ....
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再版と許可
訂正
Formal Correction: Erratum: Dissection of Adult Mouse Utricle and Adenovirus-mediated Supporting-cell Infection
Posted by JoVE Editors on 4/17/2012. Citeable Link.
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