تم وصف طريقة لتحليل التوزيع من الأسلاف نخاع العظام المكونة للدم في التدفق الخلوي، وكذلك لعزل بكفاءة عالي النقاء الخلايا الجذعية المكونة للدم (HSCs). ويستند أساسا لإجراء العزل في تخصيب المغناطيسي للخلايا + C-كيت والخلية فرز لتنقية HSCs للدراسات الخلوية والجزيئية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
المظهري التحليل وعزل الخلايا الجذعية المكونة للدم الفئران والأسلاف النسب، الملتزم
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نخاع العظام هو الموقع الرئيسي حيث HSCs وأكثر نضجا الأسلاف نسب خلايا الدم الموجودة وتفرق في كائن بالغ. HSCs يشكل سكان الخلية الدقيقة من الخلايا المحفزة قادرة على توليد خلايا الدم كل الأنساب لبعض الوقت والحياة 1. تشريح الجزيئي للتوازن HSCs في نخاع العظم لديها آثار مهمة في تكون الدم والأورام والطب التجديدي. وصفنا للبروتوكول وضع العلامات مع الأجسام المضادة فلوري والإجراءات المعزولة الإلكترونية في التدفق الخلوي ليسجل فرعية السلف المكونة للدم وتوزيع HSCs في الفئران الفردية (الشكل 1). وبالإضافة إلى ذلك، ونحن تصف طريقة لتخصيب على نطاق واسع الأسلاف المكونة للدم، وكذلك على المدى الطويل (LT) وعلى المدى القصير (ST) إعادة تشكيل HSCs من تجميع المعلقات العظام خلية نخاع بواسطة التخصيب المغناطيسي للخلايا التعبير عن C-كيت. يمكن استخدامها في إعداد الخلية الناتجة لفرز فرعية المختارة لفي المختبر، وفي الدراسات المجراة وظيفي (الشكل 2).
كلا بانيات التربيقية 2،3 و 4 جيبية البطانة تشكل منافذ وظيفية دعم HSCs في نخاع العظام. عدة آليات في محراب بانية للعظم، بما في ذلك مجموعة فرعية من الخلايا بانية العظم + N-كادهيرين (3) والتفاعل بين مستقبلات التيروزين كيناز Tie2 أعرب في HSCs مع angiopoietin-1 يجند 5 منه نتفق في تحديد HSCs السكون. "السبات" في نخاع العظام أمر بالغ الأهمية لحماية HSCs من التكرار والإرهاق في نهاية المطاف على النشاط المفرط للدراجات 6. يمكن للمنبهات الخارجية تعمل على خلايا نظام المناعة الفطرية مثل يغاندس مستقبلات على الرقم (7) ومثل انترفيرون-α 6 تحفز أيضا الانتشار وتمايز HSCs إلى الأسلاف الملتزم النسب. مؤخرا، يبلغ عدد سكانها HSCs الماوس نائمة داخل لين - C-كيت + هيئة السلع التموينية-1 + CD150 + CD48 - CD34 - وصفت سكان 8. فرز الخلايا استنادا CD34 التعبير عن تعليق الخلية المكونة للدم الأسلاف التخصيب كما هو موضح هنا يسمح للعزلة هادئة على حد سواء الذاتي تجديد LT-HSCs وST-HSCs 9. وقد تم إجراء مماثل على أساس استنفاد الخلايا إيجابية نسب والفرز من LT-شهادة الثانوية العامة مع CD48 و Flk2 الأجسام المضادة التي سبق وصفها 10. في هذا التقرير نقدم بروتوكول للتوصيف المظهري والسابقين تحليل دورة الخلية الحية من أسلاف المكونة للدم، والتي يمكن أن تكون مفيدة لرصد تكون الدم في مختلف الظروف الفسيولوجية والمرضية. وعلاوة على ذلك، ونحن تصف FACS الفرز الداخلي لHSCs، والتي يمكن استخدامها لتحديد العوامل والآليات التي تنظم احترامهن لتجديد وتوسيع والتمايز في بيولوجيا الخلية والمقايسات نقل الإشارة، وكذلك للزرع.
البروتوكول
1. إعداد تعليق خلية من نخاع العظام
- الموت ببطء الماوس ووضع الحيوان في مقلاة غير القابل للصدأ والايثانول رش 70٪ على البطن والظهر. جمع عظم الفخذ والساق من رجليه الخلفيتين، والعمود الفقري.
- إزالة بقايا بدقة جميع الأنسجة اللينة من العمود الفقري مع مقص حاد وطرف من عظام الأرجل مع الشاش. عظام مخزن في أنبوب 50 مل الصقر مع 30 مل من المتوسط RPMI التي تحتوي على 10٪ حرارة المعطل الجنين مصل بقري (FBS)، على أن تستكمل مع 50 ميكرومتر المركابتويثانول β-، 100 ميكرون MEM غير الضرورية الأحماض الأمينية، 1 الصو....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الطريقة الموصوفة هنا يمكن تحليل سريع ودقيق من تكون الدم في الفئران الفردية (الشكل 1). هذا التحليل في إعدادات التجريبية المختلفة، بما في ذلك نماذج الفئران من الالتهاب، والمناعة الذاتية، نقص المناعة، والأمراض التنكسية، واضطرابات الأيض والسرطان، ويتيح معالجة آثار الحالات المرضية على تكون الدم. ويبين الشكل 3 تحليل للنشاط الدراجات خلية في LKS بوابات إلكترونية CD34 - خلايا من الفئران والجرذان صحية مع مرض التهاب الامعاء (البنك)
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
نشكر نوبويوكي Onai، تاكيزاوا هيتوشي ومانز ماركوس للحصول على المشورة الثمينة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل العلم السويسري مؤسسة وطنية، السويسري دوري السرطان وFondazione Ticinese في لوس انجليس من Ricerca Cancro سول.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| اسم كاشف | شركة | فهرس العدد | |
| RPMI 1640 | Gibco | 42401 | |
| MEM NEAA 100X | Gibco | 11140 | |
| الصوديوم البيروفات | Gibco | 11360 | |
| PenStrep | Gibco | 15070 | |
| برنامج تلفزيوني | Gibco | 20012 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| خلية مصفاة 40 ميكرومتر | دينار بحريني الصقر | 352340 | |
| 7-AAD تلطيخ حل | دينار بحريني Pharmingen | 559925 | |
| ليز / فيكس العازلة | دينار بحريني Pharmingen | 558049 | |
| بيرم العازلة الثالث | دينار بحريني Pharmingen | 558050 | |
| كي-67 | دينار بحريني Pharmingen | 556026 | |
| دابي | إينفيتروجن | D21490 | |
| CD4 (GK1.5) | eBioscience | 150041 | |
| CD8 (53-6،7) | eBioscience | 150081 | |
| CD3 (145-2C11) | eBioscience | 150031 | |
| CD45R (RA3-6B2) | eBioscience | 150452 | |
| CD19 (6D5) | eBioscience | 150193 | |
| GR1 (RB6-8C5) | eBioscience | 155931 | |
| Tre119 (TER-119) | eBioscience | 155921 | |
| NK-1.1 (PK136) | eBioscience | 455941 | |
| ج كيت (2B8) | eBioscience | 171171 | |
| هيئة السلع التموينية-1 (D7) | eBiosciسينعقد | 135981 | |
| CD34 (RAM34) | eBioscience | 110341 | |
| FcγR (2.4G2) | eBioscience | 553145 | |
| مكافحة APC MicroBeads | Miltenyi بيوتيك | 130-090-855 | |
| LS أعمدة | Miltenyi بيوتيك | 130-042-401 |
المراجع
- Weissman, I. L. Stem cells: units of development, units of regeneration, and units in evolution. Cell. 100, 157-168 (2000).
- Calvi, L. M. Osteoblastic cells regulate the haematopoietic stem cell niche. Nature. 425, 841-846 (2003).
- Zhang, J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
