Summary
이 보고서 표면 표현, 운송 경로 및 exogenously 표현, 산도에 민감한 GFP-태그를 뉴런의 플라즈마 막에 단백질의 인신 매매 속도론을 결정하는 라이브 세포 이미징 및 photobleach 기법의 사용을 설명합니다.
Abstract
Protocol
1. 세포 배양, 바이러스성 형질 도입 및 단백질 표현
- 시험 관내 (DIV)의 14~25일위한 폴리-L-라이신-코팅 유리 coverslips에서 배아 일 18 일 (E18)의 쥐 새끼의 문화 고밀도 hippocampal 뉴런.
- 6 - 24 시간 전에 살아있는 실험으로, 슈퍼 황도 pHluorin (9월) 태그에 관심있는 막 단백질을 포함하는 감쇠 Sindbis 바이러스와 transduce 세포.
- 에어컨 미디어 1mL를 포함 coverslip에 직접 pseudovirion 함유 매체를 추가하고 문화 인큐베이터으로 돌아왔습니다. 바이러스성 형질 도입에 따라 단백질 발현을위한 titer와 시간은 바이러스 배치에 따라 다를 수 있으며, 사전 라이브 셀 실험을 시작으로 각 일괄 처리에 대한 결정되어야합니다.
2. FRAP-플립 라이브 세포 이미징
- 장비 설정
- 자이스 혈구 Axiovert LSM 510 메타 공촛점 현미경 이미징 챔버로 coverslip을 전송합니다.이미징 동안 전력 변동을 최소화하기 위해 현미경은 이미징 이전 최소 20 분 동안 100 % 레이저 출력으로 켜져되었습니다 보장합니다.
- 즉시, 미리 예열과 문화 매체를 교체 (37 ° C) 140 밀리미터 NaCl, 5 밀리미터 KCl, 15 MM 포도당, 1.5 MM CaCl 2, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 20-25 MM HEPES을 (산도가 조절이 포함된 세포외 녹음 솔루션 NaOH와 7.4)와이 자이스 혈구 Axiovert의 예비 가열 단계 (37 ℃)에서 챔버에 배치.
세포외 녹음 솔루션의 osmolarity가 배지 10 mOsM 이내로 조정됩니다 확인하십시오. 더 중요한 증발이 실험 timecourse 동안 발생하지 않습니다 제공,이 CO 2 독립적인 솔루션은 짧은 실험 (<10 시간)에 적합합니다. 1-2 밀리미터 나트륨 중탄산염으로 보완하는 것이 좋습니다.
- 영상 캡처 매개 변수를 정의
- 첫째, 재조합 프로를 표현하는 신경 세포를 식별관심 tein과 집중시키다.
- 63X 기름 반대로, 낮은 레이저 파워에서 488nm 레이저 조명 여기를 사용하여 전체 세포의 이미지를 획득. photobleaching 최소화하기 위해 전체 스캔 속도에게 <1 초 유지하는 빠른 공칭 속도 (7-9)과 낮은 픽셀 해상도 (512-512)을 사용합니다.
- 투자 수익 (~ 1.5-2.5 X 광학 줌) 포함하는 프레임을 캡처하는 이미지와 확대에 dendrite의 일부를 선택합니다. 가능하다면, 불특정 인해 인수가 발생에 photobleaching 있는지 확인하기 위해, 참고 dendrites에서 측정을 얻을 수 있도록보기의 필드가 여러 프로세스를 포함하고 보장합니다.
- 필터, 핀홀, 스캔 속도와 최소한의 레이저 여기에서 그러나 한정된 채도와 최대한의 형광을 활성화 탐지기 게인을 조정합니다. 대형 핀홀 직경은 (2μm는 쪽이 및 3 원 dendrites에 적합) 광자 컬렉션을 극대화하기 위해 권장합니다. 검출기 이득은 작은 형광 단위를 감지할 수있을만큼 강해 져야한다photobleaching 전에 처음 이미지, 포화 픽셀의 10 %를 극복하지 않는 것이 그러한.
- 사전 / 사후 표백제와 실험의 복구 단계에 사용하도록이 구성을 저장합니다.
- 다음 photobleach 영역을 정의하며 이후 반복적인 photobleaching 단계의 초기 photobleach 및 측면 지역에 대한 투자 수익 (ROI)을 선택합니다. 측면 지역은 스캔 (일반적으로 5 μm의, 그림을 참조하십시오. 2) 사이에 확산하여 복구를 방지할 수있을만큼 넓은 확인하십시오.
- photobleach의 ROIs 모두 표백 매개 변수를 조정하십시오. 초기 photobleach는 광학 줌 및 투자 수익 (ROI)의 볼륨에 따라 1-5 반복 사이에 필요로 급속한 (0.1-0.5 초)이어야합니다. 측면 지역의 경우, 레이저 여기는 측면 영역의 지속적인 photobleaching을 보장하도록 조정하지만, phototoxic 손상없이해야한다.
- 지침으로서, 우리는 반복 photobleaching 산도를 위해 100 % 레이저 초기 photobleach 위해 여기, 그리고 10 % 만 사용ASE.
- 이미지 획득
- 모든 매개 변수가 설정되고 나면, 아래의 4 블록에서 설명한 변수 촬영된 이미지 시퀀스와 같은 FRAP-플립 실험을 수행 :
BLOCK 1 : 3-10 미리 표백제를 기준 이미지, 낮은 레이저 파워에서, 시간 지연
BLOCK 2 : Photobleach 전체 레이저 파워에서 중앙 투자 수익 (ROI), 1-5 반복
BLOCK 3 : 3-10 후 표백제를 복구 이미지
4 BLOCK : 1의 전형적인 시간 간격으로 이미지 캡쳐와 함께 미디엄 레이저 파워에서 영역을 측면의 반복 photobleach - 5 초, 조사중인 단백질의 회복 속도에 따라. - 마지막으로, 140 MM NaCl, 5 밀리미터 KCl, 15mM 포도당, 1.5 MM CaCl 2, 1.5 밀리미터 MgCl 2, 20-25 MM MES (형광 끄지 위하여) 또는 50 MM을 구비를 포함 pH6에서 버퍼 녹음 솔루션 세포외 녹화 솔루션을 대체 NH4Cl 90 MM NaCl, 5 KCl MM 15 MM 포도당, 1.8 MM CaCl 2, 0.8 MM를 포함하는MgCl 2, 20-25 밀리미터 HEPES, pH7.4 (낮은 pH의 세포 내 상점에서 단백질을 표시하는 방법), (그림을 참조하십시오. 2).
- 통계 분석을 사용하려면, 각각의 재조합 단백질을 위해 최소한 10-20 데이터 집합을 수집합니다. 바이어스 결과를 피하려면되도록 이미징 조건은 복제 일관성 유지됩니다. 모든 데이터 불완전한 표백, 중요한 초점 평면 드리프트 또는 phototoxic 세포 손상이 관찰되는 위치 설정 폐기하십시오.
- 모든 매개 변수가 설정되고 나면, 아래의 4 블록에서 설명한 변수 촬영된 이미지 시퀀스와 같은 FRAP-플립 실험을 수행 :
3. 데이터 분석
- ImageJ 소프트웨어와 함께 이미지를 엽니다.
- Stackreg 플러그인 (플러그인 → stackreg → 변환을 사용하여 시계열에 걸쳐 발생했을 수 XY 평면의 작은 변화에 대해 계정에 스택을 정렬 : 딱딱한 몸을 →
). - 자이스 혈구 공촛점에 찍힌 사진을 보려면 텍스트 파일과 같은 시간 값 (플러그인 → 도구 모음 → LSM보기 LSM 도구 상자를보고 LSM 도구 모음 플러그인을 사용 →
→ )및 분석 스프레드 시트에 이러한 값을 가져옵니다. - FRAP-플립 실험 중 형광 변화를 측정하기 위해서 각각의 픽셀 영역 (~ 20pixels)로 photobleached 세그먼트를 분할하고 각 시점 (F)에서 이러한 ROIs의 평균 형광을 측정합니다. 신속하게 이러한 값을 얻으려면 ImageJ '투자 수익 (ROI) 관리자'분석 도구 (→ 도구 → 투자 수익 (ROI) 관리자를 분석)를 사용하여 여러 ROIs를 선택하고 '플롯 Z 축 프로파일'명령 (사용하는 픽셀 당 평균 형광을보고 이미지 → 스택 → 플롯 Z 축 프로파일).
- 배경이 아닌 형광 영역의 형광 강도를 측정하기 위해이 단계를 반복합니다.
- 실험적인 노이즈를 제거하고 평균 미리 표백 기준 척도에 의해 모든 가치를 나눌 배경 값을 빼서하여 각 시점에서 형광 강도를 정상화.
- 불특정의 수준을 평가하기 위해 인접하지 않은 photobleached dendrites의 형광 강도를 측정수집하는 동안 photobleaching. 불특정 photobleaching에 대한 정정은 'FRAP-뒤집기'데이터의 해석에 대해 낙심하고 가능한 한 피해야한다.
- 중요한 복구가 투자 수익 (ROI)에 자리를 차지하게되지 않으면 계산하려면 첫 번째 5-10 조치 (ΔF)의 평균에서 시퀀스의 마지막 5-10 조치의 평균을 빼야하고 통계적 의미를 결정한다. exocytosis의 패턴 (예 : exocytosis의 핫스팟이나 척추 대 샤프트 복구)을 평가하기 위해 복구 및 비 회복 ROIs를 분류합니다.
4. 대표 결과
전형 FRAP-플립 실험의 결과는 그림에 표시됩니다. 2. 여기에서, 9 월 태그에 AMPA 타입 글루 탐 산염 수용체의 GluA2 subunit을 표현 신경 세포가 선택적으로 dendrite의 지역에 따라 photobleached되었습니다. 그림 2.A는 몇 군데와 (화이트 박스 영역) photobleaching로 선정되었습니다 ROIs를 나타냅니다되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 일전자 커다란 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 빨간색 화살표는 낮은 패널 높은 배율로 표시 측정된 투자 수익 (ROI)을 나타냅니다.
그림 2.B는 실험 시간이 코스를 통해 측정된 투자 수익 (ROI)의 형광 강도를 보여줍니다. 이 예제에서는 1 분 복구 기간은 표백하지 않은 수용체는 측면 확산하여 투자 수익 (ROI)를 입력할 수 있도록 초기 photobleach 후에 기록되었다. 측면 영역이 photobleached 때, 수용체의이 고도의 운동성이있는 분수에서 형광 신호는 중앙 지역에서 occluded하고 있으며, 지역 내에 이러한 밖을 희석된다. '뒤집기'순서를 통해 관찰 형광 (ΔF)의 증가 따라서 돌기 축의 월 GluA2의 삽입에 의한 것이 있습니다. 낮은 산도 세척 및 산도 7.4은 + NH4Cl 또한 각각 측정된 형광이 표면에서 파생되었는지 확인측정된 투자 수익 (ROI) 내에서 세포, 분리된 단백질의 비율을 단백질과를 공개.
FRAP와 달리,이 방법론은 photobleached 지역의 형광 회복 크게 감소 수준의 결과로 인해 exocytosis에 복구를 분리합니다. 전혀 신뢰할 수있는 수학적 모델과 데이트도하는 것은 맞지와 회복이 선택적 표백 기술을 이용하여 기록된 흔적은 무었 분석하기 위해 개발되었습니다. 그것은 모노 지수 회복과 복구 추적에 맞게, 그러나 가능하다 :
F (t) = S - 영 전자 (-T / τ)
F (t)는 시간 t에 형광 어디있어, s는, 정상 상태 값은 0 시간 0 번 오프셋이며, τ는 일정한 시간입니다. 복구 성장 삽입 및 확산 사이의 안정된 상태로 대응하는, 평형에 도달하기 위해 주어진 속도로 고정됩니다. 중요한 것은, 시간 상수이에서 추출nalysis는 exocytosis의 지속 시간을 반영하지 않으며 오직 개인의 단백질에 대한 비교 치료에 사용될 수 있습니다.
또한, 형광 회복 예상 패턴 photobleached 지역에 따라 하위 도메인에서 관찰 가능성이 높습니다. photobleached 세그먼트 내의 작은 투자 수익 (ROI) 분석은 exocytosis "핫스팟"을 공개하는 것이 필수적이 될 수 있고 그것은 계산 속도에 영향을줍니다 dendrite 사이에 이러한 장소의 밀도 변화 같은 비교 길이의 영역을 분석하는 것이 좋습니다.
그림 3은보기의 분야에서 여러 dendrites 대형 섹션 투자 수익 (ROI)에 photobleach를 적용,이 프로토콜의 확장을 보여주는 단 하나의 dendrite의 표백 선택적 반복하여 따라갔다. 이 접근법은 전통적인 'FRAP'와 병렬로 취득되는 'FRAP-뒤집기'데이터 수 있습니다. 이 예제에서는 hippocampal 뉴런은 kainate 클래스의 글루 탐 산염 수용체 subunit에 감염되었습니다; GluK2을 월 태그를 지정했습니다. Prio이미징에 대한 R은 이러한 뉴런은-되었다 단백질 합성을 차단하는 cylcohexamide (200μg/ml에서 2 시간)로 치료. 각각의 측정 ROIs (그림 3.B)에서 같은 형광 복구 'FRAP-뒤집기'프로토콜 들어서는 dendrite에서 혼자 표준 FRAP의 dendrite 대 재활용의 측면 확산과 재활용으로 인해 회복의 비율을 밝히지 있습니다. FRAP 대 'FRAP-뒤집기'회복 곡선, 재활용의 상대적 기여도 (ΔF 레크 리에 = 11.05 %) 대 (ΔF 비교 = 9.35 %) 확산 측면에서 ΔF 값을 비교하는 것은 유추 할 수 있습니다. 그림 2와 달리 회복 단백질 합성의 억제로 인해 정상 상태 수준보다는을 유지하지 않습니다 보여줍 가능한 수용체 수영장 (휴일 약 20 % 감소의 고갈에 대한 일시적 증가와 대응, 신호의 드롭 오프 이후 촬영 기간 동안).
그림 1.이 도식은 월 태그를 수용체를 사용하여 'FRAP-뒤집기'프로토콜 대 정기 FRAP의 결과를 보여줍니다 FRAP VS FRAP-플립 프로토콜의 원칙의 도식. 전통 FRAP의 형광 복구는 왼쪽에 표시됩니다. 중앙 투자 수익 (ROI)로 측정 형광 복구 재활용 및 / 또는 돌기 축에 드 노보 exocytosis를 통해 photobleached 투자 수익 (ROI)와 수용체의 삽입 외부에서 측방 확산 F 비 photobleached 월 태그를 수용체의 조합에 따라 결정됩니다. 반대로 오른쪽에 그림 측면 ROIs의 반복 photobleached가 보여주는 방법을 수평 확산으로 인해 수정된 'FRAP-뒤집기'프로토콜 침묵 복구. 따라서 모든 측정된 형광 복구는 투자 수익 (ROI)에 직접 삽입에 의한 것이 있습니다.
그림 2.돌기 축의 플라즈마 막에 월 GluA2의 삽입
) 월 GluA2을 표현 hippocampal 신경 세포가 선택적으로 dendrite의 지역에 따라 photobleached. 상단 왼쪽 패널 photobleaching 위해 선택되었습니다 ROIs을 강조하면서 도식은 몇 군데되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 대형 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 이 패널은 photobleaching 이전 dendrite를 보여줍니다. 빨간색 화살표는 낮은 패널 높은 배율로 표시 측정된 투자 수익 (ROI)을 나타냅니다. 나) 실험 시간이 코스를 통해 측정된 투자 수익 (ROI)의 형광 강도, 투자 수익 (ROI)의 회색 레벨 (정규화되지 않음)으로 꾸몄다를 보여줍니다. 검은색 화살표는 초기 photobleach 녹색 화살표 timepoint을 강조하는 것은 반복적인 photobleaching의 시작을 나타냅니다. ΔF는 일을 나타냅니다돌기 축에 월 GluA2의 삽입으로 인해 복구 기간 동안 관찰 형광의 전자 증가. 후속 낮은 산도와 pH는 7.4 + NH 4 망할 CIA의 세차장는 회수 형광이 표현 수용체를 표면에 관한 있는지 확인합니다.
그림 3. cyclohexamide 치료를 따라 돌기 축의 재활용 및 월 GluK2의 측면 확산 대 재활용
) hippocampal 신경 세포가 평행 FRAP 및 별도의 돌기 ROIs 함께 수행한 'FRAP-뒤집기'복구 프로토콜로 선택 photobleached 월 GluK2을 표현. 이 신경 세포는 단백질 합성을 (200 μg / ML에서 2 시간) 차단, cyclohexamide으로 전처리의 대상이었다. 개략도 왼쪽 패널 photobleaching 위해 선택되었습니다 ROIs을 강조하면서 몇 군데되었습니다 dendrite의 영역을 보여줍니다. 일전자 커다란 흰 박스 영역을 두 번 가고 파란색 화살표로 강조 낮은 dendrite 유일의 측면 박스 지역의 표백 반복이어서, 일단 표백되었다. 이 패널은 이전 photobleaching에 dendrites를 보여줍니다. 빨간색 화살표는 'FRAP-뒤집기'프로토콜에 비해 전통적인 FRAP의 형광 회복을 보여주는 B의 높은 배율에 표시된 ROIs)를 강조 표시합니다. 회복의 늦은 단계 (제 3 패널)의 형광 강도의 수준을 비교 혼자 재활용 대 수평 확산과 재활용의 기여를 보여줍니다. C가) 실험 시간이 코스를 통해 측정된 ROIs의 형광 강도가 표준 강도로 꾸몄다 보여줍니다 값. 검은색 화살표는 초기 photobleach 녹색 화살표 timepoint을 강조하는 것은 반복적인 photobleaching의 시작을 나타냅니다. ΔF 우물은 FRAP / 플립 dendrite에서 결정된 수용체 재활용으로 인해 과도 회복을 나타내며 ΔF비교는 'FRAP 전용'투자 수익 (ROI)에 돌기 축으로 월 GluK2의 측면 확산의 공헌을 평가합니다. 일시적 증가 cyclohexamide 치료의 결과로 가능한 수용체의 실행 아래에 해당하는 신호의 점진적 감소, 뒤에있다. 이후 낮은 산도와 pH는 7.4 + NH 4 망할 CIA의 세차장는 회수 형광이 표현 수용체를 표면에 관한 있는지 확인합니다.
Discussion
우리는 플라즈마 막 단백질 인신 매매의 구성 요소를 시각화하기위한 혁신적인 전략을 설명합니다. 월 태그가 포함된 단백질과 기술을 photobleaching의 조합 방식은 플라즈마 막 삽입 이벤트가 평가하는 선별 수 있습니다. 지속적으로 복구하는 동안 지역 측면에서 막 단백질 photobleaching으로 'FRAP-뒤집기'방식은 형광 회복에 소낭성의 인신 매매의 공헌을 평가합니다. 이 소설의 접근법은 결정되는 일정한 상태에서 회복이 관찰되는 하위 구획의 개수 및 복구 (ΔF)의 진폭을 모두 활성화, 단백질 막 삽입 직접 녹음이 가능합니다. 또한, 플립와의없이 FRAP 비교가 계산되는 측면 확산에 대한 회복의 비율 귀책 수 있습니다.
또한, 동일한 실험에서, 측면 photobleached 지역에 인접하지 않은 photobleached dendrite의 지역이 될 수질적으로 복구하는 동안 평가,이 지역에서 관찰 형광 손실 dendrite 이러한 비 photobleached 세그먼트로 photobleached 수용체의 가로 확산으로 인한 것입니다.
이 선택적 photobleaching 프로토콜은 같은 (예를 들어, dendrites 또는 쪽이) 또는 병렬 FRAP를 실시하여 측방 확산 VS 삽입의 공헌을 평가하고 'FRAP 정의된 subareas의 혈장 막에 excocytosis을 특성화와 같은 세포 인신 프로세스의 다양한 조사를 활용할 수 인접한 dendrites 함께 - 플립 '프로토콜 (그림 3).
구체적인 지침이 제시되어있는 동안 확실히, 각 연구실에서 특정 표본과 장비에 따라 이미지 매개 변수를 최적화해야합니다. 중요한 것은 투자 수익 (ROI)의 모든 표면 수용체는 photobleached Z 축 초점 평면 독립하지만, 상당한 phototoxic 손상 또는 불특정 photobleaching없이 있어야합니다. 우리세포 소마에서이 프로토콜을하려 할 때 ERS는 상대적으로 낮은 산도 세포내 일반적으로 구획이 지역의 높은 배경 형광 결과의 높은 비율로,주의해야합니다. 또한, 이전에 선택적 photobleaching 실험을 시작으로, 방법을 다양 우리가이 기술을에 적용할 수있는 방법을 보여주면서 새로운 월 태그를 구축, 우리는 태그를 수용체의 초기 특성이 가장 먼저 애쉬 외 의해 설명된, 실시되는 조언 2.
전반적으로,이 방법은 근처에 실시간으로 평가될 수 있도록 혈장 막에 삽입 이벤트를 활성화, 표준 FRAP 프로토콜의 강력하고 다양한 적응이다.
Disclosures
관심의 어떠한 충돌 선언 없습니다.
Acknowledgments
우리는 재정 지원을위한 Wellcome 신뢰와 ERC에 감사를드립니다. IMGG은 EMBO 연구원입니다. KLH는 BBSRC 투자 박사 과정 학생입니다. 우리는 현미경과 유지 보수 및 지원을위한 기술 및 세포 문화 지원과 박사 앤드류 도허티를 위해 필립 루빈과 패트 릭 Tidball 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24mm glass coverslips | VWR international | 631-0161 | |
| Poly-l-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | 1mg/ml in borate buffer to coat coverslips |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | 2% in neuronal plating and feeding medium |
| Penicillin Streptomycin | Sigma-Aldrich | P0781 | 1% in neuronal plating and feeding medium |
| L-Glutamine | Invitrogen | 25030 | 2mM / 0.8mM in plating/feeding medium |
| Horse Serum | Biosera | DH-291H | 10% in neuronal plating media only |
| pSIN ReP5 cloning vector | Invitrogen | K75001 | For Sindbis virus production |
| LSM510 META confocal system | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Image J Software | National Institutes of Health | open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/ |
References
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