Summary
Het huidige rapport beschrijft het protocol gebruikt om het belonen van hoog-vet voedsel in muizen te meten met behulp van een progressieve verhouding operante conditionering taak.
Abstract
Voedingsmiddelen die rijk zijn aan vet en suiker belangrijke bijdrage leveren aan over-eten en stijgende tarieven van obesitas. De consumptie van smakelijk voedsel kan een belonende effect dat actie-uitkomst verenigingen versterkt en versterkt het toekomstig gedrag gericht op het verkrijgen van deze voedingsmiddelen. Steeds meer bewijs dat de moeite waard effecten van energierijk voedsel een grote rol in te veel eten en de ontwikkeling van obesitas spelen heeft verhoogde interesse in het bestuderen van de genen, moleculen en neurale circuits dat voedsel beloning 1,2 moduleren. De moeite waard invloed van verschillende stimuli kunnen worden bestudeerd door het meten van de bereidheid om te werken voor hen, zoals in operante conditionering taken 3 te verkrijgen. Operante modellen van voedsel beloning maatregel overgenomen en vrijwillige gedragsreacties die gericht zijn op het verkrijgen van voedsel. Een veel gebruikte maatstaf voor de beloning kracht is een operante procedure bekend als de progressieve ratio (PR)-regeling van versterking. 4,5 In de PR-tvragen, is het onderwerp nodig is om een toenemend aantal operante responsen te maken voor elke opeenvolgende beloning. De baanbrekende studie van Hodos (1961) toonden aan dat het aantal reacties aan de laatste beloning te verkrijgen, het breekpunt genoemd, dient als een index van beloning kracht 4. Hoewel operante procedures maatregel veranderingen in reactie alleen niet kunnen veranderingen in de sterkte beloning te scheiden van veranderingen in prestatievermogen, het breekpunt afgeleid van de PR schema is een gevalideerde maat van de belonende effecten van voedsel. De PR-taak is uitgebreid gebruikt om de beloning invloed van drugs en voedsel bij ratten (bijvoorbeeld 6-8) te beoordelen, maar in mindere mate bij muizen 9. Het toegenomen gebruik van genetisch gemanipuleerde muizen en obese muis modellen heeft verhoogd eisen voor gedragsverandering maatregelen van voedsel beloning in muizen. In dit artikel ingegaan op de materialen en procedures die worden gebruikt om muizen te leiden om (hefboom-press) te reageren voor een hoog vetgehalteen hoog suikergehalte voedselbrokjes een PR schema wapening. We laten zien dat breekpunt reactie drempels te verhogen na acute voedseltekorten en met perifere toediening van het eetlustremmende hormoon leptine en verminderen daardoor valideren van het gebruik van dit voedsel-operante paradigma in de muizen.
Protocol
* De meeste belangrijke stappen.
1. Apparatuur en Software
- Training en proeven worden uitgevoerd in muizen operant kamers voorzien van twee ultralichte intrekbare hefbomen een aan weerszijden van een voer-opvanggedeelte (zie tabel 1). Een stimulus licht boven elke hefboom en er is een huis licht aan de bovenkant van de kooi. Een pellet dispenser bevindt zich buiten de kamer. Elke kamer is gehuisvest in een geluiddichte cabine met verzachtende ventileren ventilator. Chambers zijn verbonden met een PC computer met MedPC IV software via een "Smart Control"-interface kast.
Opmerking: Wanneer ultra-lichte hefbomen niet beschikbaar zijn is het raadzaam dat de neus-poke worden gebruikt als de operante respons voor muis studies. Echter, met beide opties beschikbaar stellen wij voor de selectie van ultra-lichte hefbomen als een meer betrouwbare maatstaf voor motivatie gezien het feit dat de neus-poke reacties kunnen be veroorzaakt door verkennend snuiven.
- De MedPC programma's gebruikt om de operante taken uit te voeren zijn geschreven in Medstate notatie code die een gebruiker kan leren met de hulp van de meegeleverde programma's handleiding. Programmering flexibiliteit biedt de gebruiker bestaande codes wijzigen of unieke experimentele parameters genereren. Bepaalde codes kunnen worden verkregen voor vrij van Med Associates "Medstate Notatie Repository" http://www.mednr.com . Aanvullende codes kunnen worden gekocht bij Med Associates.
2. Muis Acclimatisering en Voedselkwaliteit Beperking
- Bij aankomst muizen zijn gehuisvest in groep voor ten minste 10 dagen om te acclimatiseren aan een omgekeerde 12 uur licht / donker cyclus en voorzien van ad libitum toegang tot standaard chow en water. In ons geval gebruiken we volwassen C57BL / 6 muizen gekocht van Charles River (St. Constant, QC). Alle muis manipulaties en gedragsexperimenten worden uitgevoerd tijdens de donkere cyclus. Alle proprocedures met betrekking tot het gebruik van dieren werden goedgekeurd door de CRCHUM Animal Care Committee.
- Muizen worden vervolgens afzonderlijk worden gehuisvest en voedsel beperkt (70% van hun dagelijkse voedselinname) tot het bereiken van 90-95% vrije voeden lichaamsgewicht om de overname van hefboom-press reageren te vergemakkelijken. Muizen kregen hun dagelijkse quotum van voedsel in de kooi na het beëindigen van de sessie. Bij het bereiken 5-10% gewichtsverlies wordt toegewezen dagelijkse voedsel aan de lagere lichaamsgewicht de rest van de stage stabiliseren. Als muizen hebben bereikt overname criteria (zie hieronder) worden ze weer op een ad libitum voeding schema. Muizen weer verloren lichaamsgewicht in ongeveer 3-4 dagen.
- Muizen worden behandeld in de test kamer voor 3 opeenvolgende dagen voorafgaand aan de eerste training. De dag voor het begin van de training 10-15 vetrijke en high-suiker (HFHS) pellets worden geplaatst in de kooi om de mogelijke invloed van voedsel neofobie op operante-optreden te voorkomence. We maken gebruik van 20 mg HFHS, stofvrij, precisie voedsel pellets (14 mg ook beschikbaar) met 48,9% Kcal als vet (Bio Serv, Frenchtown, NJ).
3. Operante Training
- Muizen worden in eerste instantie opgeleid om de hendel drukt op een vaste verhouding (FR) -1 versterking schema waarbij een enkele hendel druk op de levering van een levensmiddel pellet ontlokt aan de opvangbak. Slechts een hendel wordt aangeduid als "actief" (triggering levering van voedsel beloning) en de toewijzing van de rechter en linker hendel wordt gecompenseerd tussen de muizen. Het is belangrijk om ten minste een 5 seconden time (TO) aan de FR1 schema (FR1/TO-5), waarbij extra hefboom in te drukken niet resulteren in de levering van een levensmiddel pellet. Dit tot periode maakt tijd voor muizen om het voedsel te pellet consumeren, maar langere time-outs kunnen worden gebruikt als de experimentator voelt dat het nodig is voor hun muis model. Elke FR training duurt 1 uur of wanneer 50 pellets zijn geleverd.
- * Acquisitie Criteria: </ Strong> De criteria voor het verkrijgen van voedsel onderhouden operante reageert bepalen omvat: (1) een minimum aantal actieve reacties en beloningen verdiend, (2) een zekere mate van discriminatie tussen actieve en inactieve hefbomen, en (3) tussen-sessie prestaties stabiliteit. Muizen vertonen discriminatie van ≥ 3:1 voor de actieve versus niet-actieve hendel en het verkrijgen van ≥ 20 beloningen per sessie gedurende drie opeenvolgende sessies worden beschouwd als te bereiken overname criteria 10. We hebben gezien dat de meerderheid (~ 75%) van C57Bl6 muizen hebben ongeveer 7-10 dagen van de opleiding tot acquisitie criteria te bereiken. Muizen die geen overname kunnen worden bereikt tegen die tijd ondergaan aanvullende opleiding voor een extra 5-7 dagen. Wij sluiten muizen uit het testen van (~ 5% van de gevallen) als er geen vooruitgang geboekt door de extra 5e trainingsdag. Het is belangrijk om in gedachten te houden dat een verminderde operante overname kan een resultaat van bepaalde farmacologische en genetische interventies zijn en dient derhalve te worden gedocumenteerd. </ Li>
- Na drie opeenvolgende zittingen verkrijgen ≥ 20 pellets, wordt het schema verhoogd tot FR5/TO-5 seconden de 5 actieve hefboompersen leiden tot de aflevering van het levensmiddel pellet. Training op de FR5 schema duurt drie dagen.
- * De muizen worden dan getraind in het progressieve ratio (PR)-regeling van versterking. De respons-ratio schema tijdens de PR-test kan worden berekend volgens Richardson en Roberts (1996) 11 met de volgende formule (afgerond op het dichtstbijzijnde gehele getal):
= [5 e (R * 0,2)] - 5
waarin R gelijk is aan het aantal voedingsmiddelen punten reeds verworven en 1 (bijvoorbeeld volgende bekrachtiger). Zo is het aantal reacties moeten verdienen voedselbeloning volgt: 1, 2, 4, 6, 9, 12, 15, 20, 25, 32, 40, 50, 62, 77, 95 enzovoort. De voltooide laatste verhouding het breekpunt. - Een PR-sessie duurt maximaal 1 uur. Als de hendel drukken in een 10 minuten periode leidt tot beëindiging van de sessie. PrestatiesMance op de PR-schema van de wapening wordt als stabiel beschouwd als het aantal beloningen verdiend in een 1 uur durende sessie afwijkt ≤ 10% voor minstens 3 opeenvolgende dagen.
4. Progressieve Ratio testen en valideren
- Om te controleren voedsel onderhouden operante reageren op de PR-taak, kan men beoordelen breekpunt reageert bekend volgende manipulaties te moduleren voedsel beloning. Een relatief eenvoudige test uit te voeren is het onthouden van voedsel, die de motivationele toestand van de muis naar voedsel zal daardoor toenemen en te verhogen breekpunten. Muizen moeten eerst worden getest in de PR-taak gedurende een periode van ad libitum voeding tot stabiele, aanvang een performance wordt bereikt. De dag na de laatste "basis" dag voedsel uit de kooi en muizen worden vervolgens in de PR taak 24 uur na de start van de snel.
- We hebben ook onderzocht of perifere toediening van het eetlustremmende hormoon leptine zou het tegenovergestelde effect op breekpunt hebbendrempels. Leptine (AF Parlow, Nationale Hormoon en Peptide Program, NIDDK) werd opgelost in steriele PBS. PR de onderzoeken zijn uitgevoerd naar aanleiding van een IP-injectie van PBS op een dag en dan na de injectie van leptine (5 mg / kg) de volgende dag. Leptine werd geïnjecteerd een uur voor PR testen. Breekpunten werden vergeleken met behulp van een gepaarde t-test (GraphPad Prism).
5. Representatieve resultaten
Bij testen of voedseltekorten moduleren breekpunt reageert op een PR schema van de wapening, verwachten we aanzienlijk te verhogen breekpunten zoals weergegeven in figuur 1. In dit experiment wordt een 24-uurs periode van het onthouden van voedsel produceerde een ~ 3,6-voudige toename in de breekpunten in vergelijking met die verkregen in de vrije geeft basislijn staat, wat suggereert dat het onthouden van voedsel de belonende effecten van voedsel toeneemt. Daarentegen perifere toediening van de eetlustremmers leptine (5 mg / kg, IP) een uur vóór tsanter moeten dalen breekpunt reageren zoals weergegeven in figuur 2.
Figuur 1. Vasten vergroot het de moeite waard effecten van voedsel. Een 24 h snelle significant toegenomen breekpunten op een progressieve verhouding (PR) schema van wapening in muizen (n = 4). De gemiddelde ± SEM; * p <.05.
Figuur 2. Leptine vermindert voedsel beloning in muizen. Perifere leptine toediening (5 mg / kg) PR breekpunt aanspreekdrempels gedaald muizen (n = 4). Gemiddelde ± SEM; * p <0,05.
Discussion
Operante conditionering taken zorgen voor een effectief middel om veranderingen in de motiverende eigenschappen van voedsel te evalueren. De experimentele procedures beschreven in dit artikel vergunning training muizen om de hendel pers voor voedsel beloningen en stabiel reageren op een PR-schema van de wapening.
Het meten van de hoeveelheid verbruikte voedsel heeft niet dezelfde uitlezing als inspanning op basis van bestrijdingsmaatregelen, omdat niet alle factoren die de voedselopname beïnvloeden het moduleren van de belonen effecten van voedsel. Bijvoorbeeld, aantasten, bruikbaar glucose door de perifere 2-deoxyglucose toediening bij ratten verhoogt de hoeveelheid verbruikte vrij beschikbare voedsel, maar niet in slaagt om breekpunten te veranderen in een PR taak voor voedsel 12. PR breekpunt reageren kan ook de veranderingen in de kwaliteit van het voedsel beloningen. Bijvoorbeeld, breekpunten positief gecorreleerd met saccharose tonen dat reden voor sucrose verhogingen op een wijze die zoete smaak 8 volgt 12-14.
Bij het gebruik van dit protocol is het belangrijk om in gedachten te houden dat de verwerving van voedsel onderhouden operante reageert wordt aanzienlijk verbeterd door regelmatige training (om de 1-2 dagen) en door het verhogen van de motivationele toestand van de muis door het implementeren van een voedingsmiddel beperking regime. Daarnaast is ervoor te zorgen dat muizen vertonen relatief stabiel te reageren op een versterking schema voordat we naar meer complexe schema's (bijvoorbeeld FR1 aan FR5) is de sleutel tot het minimaliseren van de variabele prestaties tijdens het testen. Ondanks de toepassing van deze stappen is het niet ongebruikelijk om te verkrijgen wat variabiliteitbijzonder tussen muizen. Om deze reden is het sterk aanbevolen om een binnen-proefpersonen (herhaalde metingen) ontwerp te gebruiken indien mogelijk te verwijderen over de variabiliteit. Hoewel binnen-subject testen niet mogelijk is voor het onderzoeken van een stabiele genetische modificaties (dat wil zeggen, knock-out versus controle muizen) kan worden gebruikt om de invloed van drugs, letsels of acute genetische (bijv. optogenetic) manipulaties te onderzoeken.
Overgewicht en obesitas-gerelateerde ziekten zijn een groeiend probleem dat er een sterkere behoefte aan de moleculen en zenuwbanen betrokken zijn te identificeren. Opstapelen van bewijsmateriaal dat wijst op de belangrijke rol van de hersenen beloning circuits in voedsel verlangen, verhoogde calorie-inname en gewichtstoename. De PR-taak is een waardevol instrument voor het meten van de impact van de neurobiologische, genetische of farmacologische manipulaties op de beloning effecten van voedsel.
Disclosures
Productie en vrije toegang van deze video-artikel wordt gesponsord door Med Associates, Inc
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (355.881) en de Canadese Stichting voor Innovatie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mouse operant chambers |  Med Associates, Inc. |
ENV-009A | Med Associates Inc. PO Box 319 St. Albans, Vermont 05478, USA Phone: (802) 527-2343 |
| 8 inputs/16 inputs Smart Control Connection Panel | Med Associates, Inc. |
SG-716B | |
| Ultra-light retractable mouse lever | Med Associates, Inc. |
ENV-312 | |
| Pellet Dispenser | Med Associates, Inc. |
ENV-203 | |
| House Light | Med Associates, Inc. |
ENV-215 | |
| Stimulus Light | Med Associates, Inc. |
ENV-221 | |
| Dust-free Precision 20 mg high-fat & high-sugar pellets | Bio-Serv | F-06649 | Bio-Serv One 8th Street, Suite 1 Frenchtown, NJ 08825, USA Phone: (800)-996-9908 |
| Table 1. Specific equipment and material | |||
References
- Fulton, S. Appetite and reward. Front. Neuroendocrinol. 31, 85-103 (2010).
- Zheng, H., Lenard, N. R., Shin, A. C., Berthoud, H. R. Appetite control and energy balance regulation in the modern world: reward-driven brain overrides repletion signals. International journal of Obesity. 33, Suppl 2. S8-S13 (2009).
- Skinner, B. F. The Behavior of Organisms: An Experimental Analysis. , Appelton-Century. (1938).
- Hodos, W. Progressive ratio as a measure of reward strength. Science. 134, 943-944 (1961).
- Hodos, W., Kalman, G. Effects of increment size and reinforcer volume on progressive ratio performance. J. Exp. Anal. Behav. 6, 387-392 (1963).
- Stafford, D., LeSage, M. G., Glowa, J. R. Progressive-ratio schedules of drug delivery in the analysis of drug self-administration: a review. Psychopharmacology. , 139-169 (1998).
- Glass, M. J., O'Hare, E., Cleary, J. P., Billington, C. J., Levine, A. S. The effect of naloxone on food-motivated behavior in the obese Zucker rat. Psychopharmacology (Berl). 141, 378-384 (1999).
- Brennan, K., Roberts, D. C., Anisman, H., Merali, Z. Individual differences in sucrose consumption in the rat: motivational and neurochemical correlates of hedonia. Psychopharmacology (Berl). 157, 269-276 (2001).
- Vaughan, C., Moore, M., Haskell-Luevano, C., Rowland, N. E. Food motivated behavior of melanocortin-4 receptor knockout mice under a progressive ratio schedule. Peptides. 27, 2829-2835 (2006).
- Haluk, D. M., Wickman, K. Evaluation of study design variables and their impact on food-maintained operant responding in mice. Behav. Brain Res. 207, 394-401 (2010).
- Richardson, N. R., Roberts, D. C. Progressive ratio schedules in drug self-administration studies in rats: a method to evaluate reinforcing efficacy. J. Neurosci. Methods. 66, 1-11 (1996).
- Jewett, D. C., Cleary, J., Levine, A. S., Schaal, D. W., Thompson, T. Effects of neuropeptide Y, insulin, 2-deoxyglucose, and food deprivation on food-motivated behavior. Psychopharmacology (Berl). 120, 267-271 (1995).
- Fulton, S., Woodside, B., Shizgal, P. Modulation of brain reward circuitry by leptin. Science. 287, 125-128 (2000).
- Figlewicz, D. P., Bennett, J. L., Naleid, A. M., Davis, C., Grimm, J. W. Intraventricular insulin and leptin decrease sucrose self-administration in rats. Physiol. Behav. 89, 611-616 (2006).
